[发明专利]鉴定桃果实离核性状的分子标记引物组合及其应用

权利要求书

1.一种鉴定桃粘离核性状的分子标记引物组合，包括一个引物对，所述引物对从以下三个引物对中选择其一：

JYSNP-1：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTAGAGCCAATAATTTTA*G*G-3’，

R：5’-CAGAGTAAATGTTGTTAACCACT*T*G-3’；

JYSNP-2：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGATCGAGCCTTG*C*T-3’，

R：5’-CAATGCTTTTTTGGCTAAGCTAC*G*A-3’；

JYSNP-3：F：5’-TGTAAAACGACGGCCAGTCAAAGATCGAGCCTTG*C*T-3’，

R：5’-CAGAGTAAATGTTGTTAACCACT*T*G-3’；

其中，*表示为硫代修饰。

2.根据权利要求1所述的分子标记引物组合，其特征在于：还包括尾巴引物，所述尾巴引物序列为：

Tail：5’-<FAM>/<HEX>/<NED>/<PET>TGTAAAACGACGGCCAGT-3’。

3.权利要求1或2所述的分子标记引物组合在鉴定桃粘离核性状中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其步骤包括：

(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中之一；

(2)DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA；

(3)PCR扩增：基于上述桃基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物JYSNP-1、JYSNP-2或JYSNP-3进行PCR扩增；

(4)扩增产物检测与分析：对扩增产物进行琼脂糖电泳检测条带大小分析，确定桃果实粘离核性状。

5.根据权利要求3所述的应用，其步骤包括：

(1)引物设计合成：合成权利要求1所述的引物JYSNP-1、JYSNP-2和JYSNP-3其中之一，以及尾巴引物；

(2)DNA的提取：提取桃嫩叶中的基因组DNA；

(3)PCR扩增：基于上述桃基因组DNA，使用步骤(1)合成的引物JYSNP-1、JYSNP-2或JYSNP-3进行PCR扩增；

(4)扩增产物检测与分析：对扩增产物使用尾巴引物在ABI遗传分析仪上进行分析，确定桃果实粘离核性状。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：步骤(2)DNA的提取具体为：

A、用液氮研磨0.2g左右的嫩叶成粉末状置于2mL离心管中；

B、加入0.8mL 65℃预热的CTAB裂解液后混匀，裂解液的配方为：100mmol/L pH 8.0的Tris·Cl，20mmol/L pH 8.0的EDTA，1.4mmol/L NaCl，2.5％CTAB(M/V)，3％PVP(M/V)、2％β-巯基乙醇(V/V)；65℃水浴1h，期间不时轻轻摇动；

C、水浴结束待冷却后加入0.8mL抽提混合液后混匀，抽提混合液的配方为：氯仿：异戊醇＝24：1(V/V)；4℃、10000rpm离心10min，将上清液移入新的2mL离心管中，重复加入0.8mL抽提混合液后混匀，4℃、10000rpm离心10min；

D、将上清液移入新的2mL离心管中，加入等体积的经-20℃预冷的异丙醇，混匀，室温静置30min；吸出絮团状沉淀，用70％乙醇洗涤；

E、超净工作台吹干剩余乙醇后，用0.2mL ddH₂O溶解DNA；同时取1～2μl在1.0％的琼脂糖凝胶上检测，DNA原液稀释成浓度为80ng/μl的工作液保存于-20℃冰箱；