[发明专利]一种增强型自然杀伤细胞的培养方法

权利要求书

1.一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于，步骤包括：

S1、分离得到中性粒细胞和PBMC；

(1)抽取捐献者外周血20-100ml，

(2)配制淋巴细胞分离液：

a.用9份Percoll加1份生理盐水配制成Percoll原液；

b.用生理盐水稀释Percoll原液为70％Percoll浓度的A液和50％Percoll浓度的B液；

(3)将A液加入到离心管中，然后将B液缓慢加入A液上层，于室温平衡后再缓慢加入外周血，通过密度梯度离心分离分别获得PBMC及中性粒细胞；

S2、对中性粒细胞负载唑来膦酸；

(1)用生理盐水分别洗涤PBMC和中性粒细胞后用RPMI-1640培养基分别重悬、培养2个小时后并计数；

(2)PBMC培养2小时后，将PBMC中的未贴壁的细胞洗脱，在PBMC培养瓶中用生理盐水重悬离心，将获得的PBMC用第一培养液培养，经过第一培养液培养后的PBMC称为细胞C；

第一培养液的组成包括GT-T551 H3、10％自体血清和2000IU IL2；

(3)将中性粒细胞加入到PMBC贴壁的细胞培养瓶中，并加入第二培养液培养，经过第二培养液培养的细胞称为细胞D；

第二培养液的组成包括RPMI-1640、10％自体血清和5μM唑来膦酸；

(4)24小时后，将细胞D使用生理盐水洗涤3遍，然后将细胞C连同第一培养液一起倒入细胞D中；

(5)每隔3天补入双倍体积的RPMI-1640培养基到步骤(4)中的培养瓶中，连续培养14-21天；

S3、将负载唑来膦酸的中性粒细胞和PBMC加入到NK细胞中进行培养。

2.根据权利要求1所述的一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：将细胞C、细胞D加入到培养NK细胞的培养基后通过流式细胞仪分析NK细胞表型。

3.根据权利要求1所述的一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，其特征在于：获得的NK细胞在体外杀伤效果通过A549、K562、Hep G2进行评价。