[发明专利]一种增强型自然杀伤细胞的培养方法

说明书

本发明公开了一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，步骤包括：S1、分离得到中性粒细胞和PBMC；S2、对中性粒细胞负载唑来膦酸；S3、将负载唑来膦酸的中性粒细胞和PBMC加入到NK细胞中进行培养。本发明采用上述一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，提高了NK细胞的纯度，大大提高了NK细胞临床应用的安全性，节省了成本。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，特别是涉及一种增强型自然杀伤细胞的培养方法。

背景技术

近年来，癌症的发病率呈现直线上升的趋势。根据(2012中国肿瘤登记年报》，我国癌症发病率为285.91/10万，城市和农村发病率分别为303.91/10万和249.98/10万。据估计，至2049年，我国癌症发病率可能达到400/10万的水平。癌症发病率升高的最主要原因是人口老龄化，现今我国老龄人口所占比例为13.6％，20-30年后可能达到16％。

目前，虽然手术、化疗、放疗等治疗措施在不断发展，但晚期恶性肿瘤患者的预后情况仍然很差，5年生存率不到15％。

随着肿瘤生物学、分子生物学和免疫学的发展，免疫治疗已成为继传统肿瘤治疗方法(手术、化疗、放疗)后的第四种肿瘤治疗模式。大量研究表明，过继性细胞免疫治疗对晚期恶性肿瘤患者具有其他治疗方式无法比拟的优越性，是有效的治疗手段之一，具有广阔的临床应用前景。

传统的肿瘤治疗手段靶向性差，副作用大，容易产生比较强的耐药现象，同时还有转移复发的危险，难以根除肿瘤细胞。过继性细胞免疫治疗将体外培养、活化、基因修饰的免疫细胞回输给患者，其目标在于清除肿瘤细胞和阻止肿瘤复发，提高病人的生存率和生活质量。它对于对细胞免疫功能低下的患者，如大剂量化疗、放疗后、骨髓移植后、病毒感染损伤免疫细胞数量及功能的患者极为合适。

随着过继性细胞免疫治疗的不断发展，这一领域也经历了几次重大突破。研究较多的免疫细胞种类有肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltratinglymphocytes，TIL)、LAK、细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer cells，CIK)、供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion，DLI)、NK-92、EBV特异性CTL细胞系、T细胞受体(T cellreceptor，TCR)或CAR基因修饰的T细胞。

NK细胞是人体免疫系统中的核心细胞，它的抗癌活性最强，是人体第一道屏障、抗癌的第一道防线。NK细胞主要通过以下四种途径杀伤病毒感染或者异变的靶细胞：通过释放颗粒酶、穿孔素直接杀伤靶细胞；通过死亡受体配体(如TRAIL或Fasl)介导肿瘤细胞凋亡；通过抗体依赖的细胞因子介导的细胞毒作用(ADCC)杀伤靶细胞；细胞因子介导的杀伤作用。另外，NK细胞不会杀伤正常细胞，因为正常细胞表面的MHC-I类分子与NK细胞表面的抑制性受体相结合可以避免NK细胞的攻击。

如何在体外大量扩增纯化NK细胞，如何增强NK的杀瘤活性，是现今过继性免疫疗法的重点和难点。

现有的NK细胞体外扩增技术主要有2个：因子法和滋养层法。因子法是在多种细胞因子的作用下激活扩增NK细胞，往往纯度和活力都达不到临床要求，且需要的因子组合包含CD16单抗、OK432，IL15等等，这些因子都是非常昂贵的，而且操作复杂。滋养层法是用滋养层细胞(往往是肿瘤细胞系)在体外激活扩增NK细胞，这种方法会导致滋养层细胞的DNA残留，基因组整合等风险，在日本等细胞治疗先进的国家是禁止使用的。

发明内容

本发明的目的是提供一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，提高了NK细胞的纯度，大大提高了NK细胞临床应用的安全性，节省了成本。

为实现上述目的，本发明提供了一种增强型自然杀伤细胞的培养方法，步骤包括：

S1、分离得到中性粒细胞和PBMC；

S2、对中性粒细胞负载唑来膦酸；