[发明专利]一种高纯免疫球蛋白G的制备方法

说明书

本发明提供了一种高纯免疫球蛋白G的制备方法，使用盐析结合层析方法从动物血清中分离免疫球蛋白G，并采用改进的紫外光辐照灭活方法进行病毒灭活。

技术领域

本发明属于蛋白领域和生物制品领域，具体地，本发明提供了一种高纯免疫球蛋白G的制备方法，使用盐析结合层析方法从动物血清中分离免疫球蛋白G，并采用改进的紫外光辐照灭活方法进行病毒灭活。

背景技术

免疫球蛋白是血浆中除白蛋白外含量最丰富的血浆蛋白质，约占血浆蛋白总量的12％～15％。哺乳动物的免疫球蛋白在基因序列、氨基酸组成以及蛋白质结构上存在较高的相似性，它们的生理功能和生理作用基本一致：免疫球蛋白分子的基本单位都是由四条肽链构成的对称结构，包括两条相同的重链和两条相同的轻链，其中，轻链又分为κ和λ两种结构类型；其主要生理功能和作用是通过特异性结合相应抗原、活化补体以及结合Fc受体产生抗体依赖的细胞介导细胞毒作用和调理吞噬作用，阻断或消除各种病原体对机体的致病作用，并通过抗体补充和免疫调节作用对多种疾病起到治疗作用。

血浆免疫球蛋白可分为五种类型，其中免疫球蛋白G(IgG)占免疫球蛋白总量的约70％～80％，是最重要的一类免疫球蛋白，临床使用的免疫球蛋白制品中主要是IgG，IgG输注是一种被动免疫疗法，主要应用于免疫低下症、替代治疗、预防某些病毒和细菌感染等。

血清是指从哺乳动物血管中采集的全血经自然凝固后析出的淡黄色液体，经进一步离心分离制得的动物血清；与从抗凝全血分离的血浆相比，血清中已经去除了纤维蛋白原及多种凝血因子等多种蛋白质成分，血清中的蛋白质组成成分更少，主要有白蛋白、免疫球蛋白及其他一些微量蛋白质。血清是制备免疫球蛋白的良好原料

在纯化血清免疫球蛋白时，由于血浆/血清等原料中含有多种蛋白质，单一的纯化方法往往达不到要求，通常是多种纯化方法相结合，从而达到纯化免疫球蛋白的目的；目前，国内外药用免疫球蛋白的纯化方法主要以传统的低温乙醇法为主，该方法对设备要求高，反应步骤需要控制在低温下进行；分离步骤多、周期长、工艺条件的控制比较复杂，能源消耗巨大，而且纯化过程中常会导致多聚体的生成等。此外，动物血清中可能存在的会影响人体的病毒以及动物筛查的困难性使得病毒灭活过程不可或缺，常见的病毒灭活方法中高温热处理法、低pH处理法等不适用于血清，目前使用的苯酚法、S/D法在残留物和产物安全性上有潜在缺陷，而亚甲基蓝等光化学处理方法对无囊膜病毒灭活效果很差。

因此，本领域中对纯度高、工艺简单、安全性好的免疫球蛋白G制备方法仍然有很大需求。

发明内容

针对上述问题，发明人采用盐析沉淀分离法代替低温乙醇分离法，对免疫球蛋白G进行粗纯化，初步纯化的免疫球蛋白G再进行层析分离，达到快速简单制备高纯度血清免疫球蛋白G的目的。此外，发明人在研究血浆病毒灭活时发现特定比例的药用芦丁以及一定的钠离子浓度下，UVC光化学灭活法能有效灭活有囊膜和无囊膜病毒(见本申请同日申请：芦丁可以与病毒核酸结合，在UVC光照条件(500～5000μw/cm²，120～1200s辐照)下可以使病毒核酸产生缺口而无法完成复制，从而达到灭活病毒的作用；由于该方法直接作用于病毒核酸，所以该方法对有囊膜和无囊膜病毒均具有较好的灭活效果，进而解决了亚甲基蓝光化学法只能灭活有囊膜病毒，不能灭活无囊膜病毒的问题)，发明人将这一技术调整后用于免疫球蛋白G制备中的血清病毒灭活，其中使用的盐浓度与层析上样缓冲液盐浓度接近，灭活病毒后的溶液可以直接上样层析柱，进一步简化了制备流程。

一方面，本申请提供了一种高纯免疫球蛋白G的制备方法，其特征在于，以动物血清为原料，使用包括盐析和层析分离步骤制备。

进一步地，其中动物血清为马血清或犬血清。

进一步地，所述高纯免疫球蛋白G的制备方法包括：

(1)将原料血清用生理盐水稀释至蛋白质浓度≤40mg/mL；