[发明专利]一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用

权利要求书

1.一种尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，从尿液中提取干细胞，然后在滋养层细胞上，用尿源性肾干细胞培养液培养，得尿源性肾干细胞；

所述滋养层细胞为成纤维细胞，所述尿源性肾干细胞培养液中含有DMEM培养基200-300ml、F12培养基200-300ml、胎牛血清20-70ml、L-谷氨酰胺0.2-2mM、胰岛素1-14ng/ml、表皮生长因子0.1-1ng/ml、腺嘌呤5-30μg/ml、氢化可的松2-20μg/ml。

2.根据权利要求1所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，滋养层细胞来源于胚胎成纤维细胞；

所述胚胎成纤维细胞包括已建系的胚胎成纤维细胞和原代培养获得的胚胎成纤维细胞。

3.根据权利要求1或2所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，滋养层细胞为小鼠胚胎成纤维细胞3T3-J2。

4.根据权利要求1～3中任一所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

干细胞的提取步骤，收集尿液，离心，弃上清后，得残留液，加入洗涤缓冲液进行洗涤，然后离心，得细胞沉淀，加入尿源性肾干细胞培养液，重悬细胞，得细胞悬浮液；

铺被滋养层细胞的培养器皿的准备步骤，将已经用辐照灭活的滋养层细胞铺于培养器皿底部，放入细胞培养箱中过夜或隔天后待使用；

肾干细胞的筛选与培养步骤，将上述干细胞悬浮液铺到滋养层细胞上进行培养，得尿源性肾干细胞。

5.根据权利要求4所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，在所述干细胞的提取步骤中，所述尿液与尿源性肾干细胞培养液的体积比为(100-200)：1。

6.根据权利要求4或5所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，在所述铺被滋养层细胞的培养器皿的准备步骤中，取滋养层细胞加入滋养层细胞培养基进行传代培养，待细胞数量扩增至1×10⁸-2×10⁸个细胞后，消化细胞，离心，弃上清，收集细胞沉淀，重悬，得到浓度为1×10⁶-1×10⁷个/mL的重悬细胞液，用γ射线辐照，然后将基质胶加入培养器皿中，孵育，吸弃基质胶并按照5×10³-2×10⁵个/cm²的密度加入滋养层细胞，滋养层细胞贴壁，得到铺被滋养层细胞的培养器皿。

7.根据权利要求4～6中任一所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，在所述肾干细胞的筛选与培养步骤中，在滋养层细胞贴壁后，将干细胞悬浮液铺在滋养层细胞上，培养3～5天进行第一次细胞换液，然后以每2～3天1次的频率进行细胞换液，传代培养，得尿源性肾干细胞。

8.根据权利要求1～7中任一所述的尿源性肾干细胞的培养方法，其特征在于，所述尿液来源于慢性肾病患者的中段尿液。

9.权利要求1～8中任一所述的尿源性肾干细胞的培养方法所制得的尿源性肾干细胞在药物筛选、生理病理学研究、细胞治疗和肾脏组织工程中应用。