[发明专利]一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用

说明书

本发明提供了一种尿源性肾干细胞的培养方法，属于细胞生物领域，包括如下步骤，从尿液中提取细胞，然后在滋养层细胞上，用尿源性肾干细胞培养液培养，得尿源性肾干细胞；所述滋养层细胞为成纤维细胞，所述尿源性肾干细胞培养液中含有DMEM培养基200‑300ml、F12培养基200‑300ml、胎牛血清20‑70ml、L‑谷氨酰胺0.2‑2mM、胰岛素1‑14ng/ml、表皮生长因子0.1‑1ng/ml、腺嘌呤5‑30μg/ml、氢化可的松2‑20μg/ml，采用本发明的方法能够得到具有较高增殖能力和特异性的肾干细胞，从而能够提高对肾脏损伤组织的修复效果。

技术领域

本发明涉及细胞生物领域，具体涉及一种尿源性肾干细胞的培养方法及其应用。

背景技术

由各种肾脏相关疾病或毒性物质引发的终末期肾衰竭是困扰医学界的一大难题。目前治疗肾衰竭的唯一有效的根治手段是原位肾移植。而由于受到供体器官短缺和手术繁复、耗费大、并发症繁复等因素制约，肾移植并不适用于所有终末期肾衰竭患者。近年来，作为器官移植的替代治疗手段，细胞移植在血液系统疾病、自身免疫病以及心、肝、肾等重要器官的功能性障碍等医学的领域的作用日渐得到重视，其潜在的应用价值使得细胞移植研究领域取得了巨大的进展。其优点包括细胞来源广泛、治疗过程低创以及避免了异体器官移植带来的免疫排斥和伦理问题等。

在使用细胞移植手段治疗急性或慢性肾损伤的应用中，种子细胞的选择至关重要。目前再生医学领域认为具有潜在应用价值的种子细胞包括异体全能干细胞、诱导性多能干细胞、成体多能干细胞和成体组织特异性干细胞等。其中，成体组织特异性干细胞能够从自体组织中获取，且具有定向分化成特异的组织器官的特点。此外，与异体全能干细胞和诱导性多能干细胞等种子细胞相比，成体组织特异性干细胞获取相对容易、不具成瘤性，不存在组织相容性问题和伦理争议，作为种子细胞具有极大优势。

为此，在论文《人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠》中公开了一种采用人尿液分离得到具有间充质干细胞特性的成体干细胞的方法，研究者将分离得到的成体干细胞移植入慢性肾病SD大鼠两侧肾脏皮质内，结果显示其能够降低大鼠的血清肌酐，提高肾小球滤过率，肾功能有所改善。然而，人尿液中存在多种干细胞，如间充质干细胞和肾干细胞等，由于尿液中肾干细胞含量低，分离难度大，因此上述方法中仅采用常规的干细胞培养方法，并不能有效地从尿液中筛选出具有再生肾脏组织能力的肾干细胞，所分离获取的干细胞为间充质干细胞，具有间充质干细胞的各种生物学特性。然而，一方面，由于间充质干细胞本身就不具备分化形成肾脏细胞的潜能，使得移植入体内的间充质干细胞很难整合到肾脏中，另一方面，当间充质干细胞移植入动物体内后往往会通过提供分泌因子发挥免疫调控作用，间充质干细胞在体内存活期较短，使得大鼠的肾损伤结构无法得到修复。这就极可能造成其在临床应用中，病情反复的几率很大，具有一定的局限性(赵雅培等，人尿源干细胞移植治疗慢性肾病大鼠.中国组织工程研究，2016，20(32):4838-4844)。

因而，建立一种从尿液中筛选分离具有肾脏损伤结构修复能力的肾干细胞的方法对于药物筛选、生理病理学研究、细胞治疗和肾脏组织工程具有十分重要的意义。

发明内容

因此，本发明要解决的技术问题在于克服现有技术因无法从尿液中分离培养制得具有肾脏损伤结构修复能力的肾干细胞而导致移植治疗的肾脏损伤组织难以修复的缺陷，从而提供一种尿源性肾干细胞的培养方法。

本发明提供了一种尿源性肾干细胞的培养方法，从尿液中提取干细胞，然后在滋养层细胞上，用尿源性肾干细胞培养液培养，得尿源性肾干细胞；

所述滋养层细胞为成纤维细胞，所述尿源性肾干细胞培养液含有DMEM培养基200-300ml、F12培养基200-300ml、胎牛血清20-70ml、L-谷氨酰胺0.2-2mM、胰岛素1-14ng/ml、表皮生长因子0.1-1ng/ml、腺嘌呤5-30μg/ml、氢化可的松2-20μg/ml。

进一步的，所述滋养层细胞来源于胚胎成纤维细胞；