[发明专利]一种用于检测埃博拉病毒的引物组、组合物及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测埃博拉病毒的引物组、组合物及试剂盒。本发明根据发现收录并测序的埃博拉病毒全基因组序列设计了用于检测埃博拉病毒的引物组，包括具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物，并提供了包括靶点探针和上述引物组的组合物，靶点探针具有SEQ ID NO.3所示核苷酸序列，靶点探针的两个末端分别标记荧光基团和淬灭基团；还提供了包括上述组合物的试剂盒，试剂盒还包括PCR缓冲液、Mn²⁺、dNTPs、TTH酶、UNG酶和核酸提取试剂。本发明提供的引物组、组合物及试剂盒能够覆盖埃博拉病毒的各分型和压型，并具有准确度高和灵敏度高的优点。

技术领域

本发明涉及埃博拉病毒(EBOV)的检测技术领域，具体涉及一种用于检测埃博拉病毒的引物组、组合物及试剂盒。

背景技术

埃博拉病毒病(ebola hemorrhagic fever,EBHF)是一种由埃博拉病毒(ebolavirus,EBOV)引起的人畜共患烈性传染病。EBOV因高致病性、病死率高，被WHO列为对人类危害最严重的病毒之一。

目前埃博拉病毒检测普遍采用一步法检测PCR试剂或荧光染料PCR试剂来检测患者血液中的EBOV病毒(如专利：201110312915.2和201110312855.4)。此类试剂虽然操作简便，但存在准确度低，抗干扰能力差，灵敏度不足等问题。对于中低水平的病毒载量(低于1000copy/mL)容易出现无法检出等问题，同时低水平的病毒载量处于病毒潜伏期及发病初期，该时期容易是病毒传播的关键时期，为此对于疫情的控制，需要在低浓度水平及表现初期症状时即进行隔离或治疗控制。因此在埃博拉疫控区域内需要高灵敏度和高准确度的检测试剂。

染料法检测试剂缺陷：市面上常用SYBR Green荧光染料和LC Green荧光染料用于染料荧光PCR，该技术方法采用荧光染料与双链DNA结合发出荧光，单链DNA结合不发出荧光的特性，通过每个循环的PCR扩增，增加的双链DNA数量，从而使荧光信号增加，以实现实时荧光PCR检测，但该技术存在特异性差，灵敏度低、假阳性高等问题，原因在于荧光染料不具特异性，即对于引物二聚体、非特异性扩增等双链DNA分子均能产生荧光信号。

一步法检测试剂缺陷：无核酸提取纯化过程，外周血中的杂质难以完全去除，导致PCR过程容易发生抑制或干扰，导致无法检测等情况；不同患者外周血干扰物质浓度和种类不同(血脂、血红蛋白、治疗药物等)，导致定量的个体差异大、重复性差和准确度低；外周血不经过病毒核酸浓度过程，导致灵敏度低。

目前现有埃博拉病毒检测产品针对埃博拉的RNA检测，均采用逆转录酶和DNA聚合酶组合的双酶体系，由于逆转录酶的热敏感性，荧光PCR仅能在较低温度下进行逆转录反应，在高温下激活DNA聚合酶的同时进行逆转录酶的失活。但在整体检测过程中无法使用防污染酶系UNG酶及dUTP体系，在长时间和大量检测使用后，容易出现PCR产物污染从而导致假阳性的出现。

发明内容

本发明的目的在于提出一种用于检测埃博拉病毒的引物组、组合物和试剂盒，具有定量准确度高的特点。

为了实现上述目的，本发明采用以下的技术方案：

一种用于检测埃博拉病毒的引物组，包括：具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物；或，

具有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的正向引物和具有SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的反向引物，所述正向引物和反向引物中的至少一种的核苷酸序列经过修饰，所述修饰的方法包括甲基化修饰，通过天然核苷类似物取代一个或多个天然核苷酸和核苷酸间的修饰，在核苷酸序列中或两端添加一个或多个核苷酸残基、基团的修饰，将核苷酸序列中的一个或多个核苷酸残基替换成其它的核苷酸残基的修饰。