[发明专利]一种适用于CHO细胞培养用无蛋白培养基及其培养方法

说明书

本发明公开了一种适用于CHO细胞培养用无蛋白培养基及培养方法，所述培养基由基础培养基和流加培养基组成，所述基础培养基内不含有谷氨酰胺，且所述基础培养基内含有二肽形式的谷氨酰胺与半胱氨酸；所述流加培养基含有谷胺酰胺与半胱氨酸；所述基础培养基内半胱氨酸的浓度在0.08‑0.15g/L，二肽形式的谷氨酰胺的浓度在2.8‑8.0mmol/L；所述流加培养基中半胱氨酸的浓度在0.05‑0.12g/L，谷氨酰胺的浓度在4.0‑6.5mmol/L。使用二肽形式的谷氨酰胺代替谷氨酰胺，谷氨酰胺二肽十分稳定，不容易发生水解和氨的毒性堆积，又可被细胞所利用，添加适量的半胱氨酸使细胞生长展现出令人满意的生长性能。

技术领域

本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种适用于CHO细胞培养用无蛋白培养基及其培养方法。

背景技术

基因重组治疗性抗体(包括受体-Fc融合蛋白等抗体样分子)的研发和产业化，是其发展的关键。由于基因重组治疗性抗体上游构建技术和大量生产抗体的动物细胞大规模培养技术的落后，我国现在最高生产水平非常低，产量低导致生产成本高居不下，项目难以产业化。适宜的培养基和大规模培养工艺是目前制约重组抗体类药物表达水平的两大瓶颈。而其中找到适合培养的细胞培养基对整个生产的作用尤为重要。

20世纪80年代初期，在世界卫生组织(WHO)明确了哺乳动物传代细胞可用于生物制品生产以后，哺乳动物细胞在生物技术药物的研发中获得了长足发展。目前，用于生物制药的真核表达系统中，中华仓鼠卵巢细胞系(Chinese hamster ovary cell line，CHO)是应用最为广泛的，在美国和欧盟已批准的以哺乳动物细胞生产的生物药品中，利用CHO系统的占60％以上，且比例不断上升。

谷氨酰胺是细胞生长代谢过程中很重要的氮源物质，在细胞培养基中它是维持细胞生长必不可少的组分，为细胞的生物合成提供能源。而生产蛋白类药物的动物细胞(如CHO细胞)对谷氨酰胺的利用具有消耗快、代谢率低的特点。谷氨酰胺在细胞培养基中会发生自发分解，细胞培养基的储存温度越高，存放时间越久，谷氨酰胺分解的越快。谷氨酰胺分解后导致氨的形成，1分子谷氨酰胺经过代谢进入三羧酸(TCA)循环要产生2分子的铵离子，铵离子的累积对细胞生长会产生毒害作用。

目前，商业化的基础培养基在DHC细胞的大规模培养中，多采用批次流加培养方式不断的补充谷氨酰胺以维持培养基内细胞生长所需氮源浓度，同时谷氨酰胺会不断分解产生铵离子，铵离子的生成约为0.2～0.6mM/106cells/天，易造成铵离子累积。

因此，为解决在动物细胞培养过程中谷氨酰胺易被耗竭及其代谢副产物铵离子严重累积这一关键技术难题，中国专利CN104894055A公开了一种优化的细胞培养基，其通过在基础培养基中同时添加谷氨酰胺和谷氨酸，并控制其浓度，以满足细胞在生产培养的前期，主要代谢消耗谷氨酰胺的需求，当谷氨酰胺消耗尽时，细胞会转而利用谷氨酸，这样有力的保证了谷氨酰胺的耗尽对细胞的生长代谢没有影响，同时又能很好的将铵离子控制在细胞耐受范围内。但在动物细胞培养过程中，对于一些特定的细胞，谷氨酰胺的浓度也有相应的浓度要求。例如对于dhfr-CHO细胞(二氢叶酸还原酶缺陷型)，谷氨酰胺的浓度要达到4mmol/L时，方可满足细胞的正常生长。在上述专利中细胞生长前期快速消耗谷氨酰胺，随着谷氨酰胺浓度逐渐降低，会影响细胞的正常生长。

发明内容

针对上述背景技术中的问题，本发明目的在于提供一种适用于CHO细胞培养用无蛋白培养基，在细胞培养过程中维持谷氨酰胺的浓度水平，避免谷氨酰胺出现耗尽现象的同时避免铵离子浓度积累过高，保证细胞的生长性能。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案为：