[发明专利]非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒

权利要求书

1.一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，包括特异性引物ASFV-F和ASFV-R，以及标记有THF残基的RAA-exo探针ASFV-P，探针标记的报告荧光染料为FAM，标记的荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和RAA-exo探针序列如下：

ASFV-F:5′-TCGCCGAAGGGAATGGATACTGAGGGAATA-3′；

ASFV-R:5′-AGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGT-3′；

ASFV-P:5′-TGCGTATCATTTTCATCGGTAAGAATAGGTT[FAM-dT][THF]C[BHQ1-dT]TTGGTGCGGCTTGTGC-3′。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括荧光RAA反应单元、Buffer A、Buffer B，阳性对照以及阴性对照。所述的荧光RAA反应单元，含有重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、核酸外切酶冻干酶粉；Buffer A为水解缓冲液；Buffer B为醋酸镁溶液；阳性对照为含有非洲猪瘟病毒p72基因的pUC57-p72质粒，阴性对照为空载体pUC57质粒。

3.根据权利要求2所述的一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

(1)人工合成非洲猪瘟病毒p72基因全长序列(登录号：MH713612.1)克隆到pUC-57载体上，经大肠杆菌工程菌纯培养后提取质粒作为阳性对照；

(2)权利要求1中的引物组和探针制备：

根据p72基因的保守区，设计特异性引物ASFV-F和ASFV-R，以及RAA-exo探针ASFV-P，用四氢呋喃(THF残基)，dT-荧光团和dT-淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，THF残基的5′端方向标记的报告荧光染料为FAM，THF残基的3′端方向标记荧光淬灭基团为BHQ-1，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号；

(3)重组酶、单链结合蛋白、链置换DNA聚合酶、核酸外切酶冻干酶粉、水解缓冲液、醋酸镁溶液及去离子水，为商品化制备。

4.利用权利要求2所述的非洲猪瘟病毒试剂盒快速检测非洲猪瘟病毒的方法，其特征在于，包含以下步骤：

1)在荧光RAA反应单元中加入45.5μL水解缓冲液，2μL阳性对照/阴性对照/待检核酸，在反应管中加2.5μL醋酸镁溶液，盖上盖子离心，上下颠倒混匀，离心10秒，立即检测；反应程序为：39℃40秒；39℃30秒40个循环，此处采集荧光信号，20min可完成检测；

2)结果判定

①阳性对照：有典型的扩增曲线出现，出峰时间小于15min(Ct值≤30)，为有效结果；

②阴性对照：无扩增曲线出现，或出峰时间≥20min(Ct值≥40)，为有效结果；

③被检样本：

a.若出峰时间≤17.5min(Ct值<35)，判断为阳性；

b.若出峰时间≥20min(Ct值≥40)，判断为阴性；

c.若17.5min<出峰时间<20min(35<Ct值<40)，判为可疑，需重复检测进行确认；再次检测结果仍然是17.5min<出峰时间<20min(35<Ct值<40)，应参照阴性对照出峰时间(Ct值)，若阴性对照出峰时间≥20min(Ct值≥40)，则判断为阳性。