[发明专利]非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，包括特异性引物ASFV‑F和ASFV‑R，以及RAA‑exo探针ASFV‑P，用四氢呋喃(THF残基)，dT‑荧光团和dT‑淬灭团取代靶标扩增子序列内的碱基，标记的报告荧光染料为FAM，荧光淬灭基团为BHQ‑1，试剂中的核酸外切酶可在THF位点裂解探针，从而分离荧光基团和淬灭基团并产生荧光信号。本发明提供的试剂盒可在37～42℃恒温条件下，20min内实现非洲猪瘟病毒的检测，特异性为100％，检测敏感性为10copies/μl。因此，本发明的试剂盒具有操作简单、快速、灵敏的特点，为非洲猪瘟病毒的现场快速检测筛查提供有效的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，属于生物工程技术领域。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的家猪和野猪的一种烈性、出血性传染病。急性型以高热、网状内皮系统出血和高致死率为特征，病死率接近100％。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须申报的一类疫病，对养猪业危害较大。2018年8月我国辽宁省首次报道非洲猪瘟疫情，标志着非洲猪瘟传入我国，给我养猪业造成巨大损失，由于尚无有效的疫苗防治，所以建立一种快速、准确的检测方法就显得尤为重要。

重组酶介导链替换核酸扩增技术(Recombinase-aid Amplification，RAA)，是一种恒温核酸快速扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链DNA结合蛋白的帮助下，打开模板DNA的双链结构，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，扩增产物以指数级增长。利用荧光探针的标记、生物素标记的引物和核酸外切酶酶切，可以实现定时定量的结果分析，通常20min就可以得到荧光检测结果。

目前，ASF尚无有效疫苗预防及治疗方法，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。OIE推荐的HAD、ELISA、IFA等血清学检测方法，耗时长，操作复杂，不适用与非洲猪瘟病毒的快速检测。RAA技术具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低的优点，在基因检测领域具有广阔的应用前景。

基于此，本研究选取非洲猪瘟病毒高度保守的p72基因(编码B646L结构蛋白)作为靶基因，设计特异性引物及探针建立ASFV特异的荧光型RAA检测试剂盒及检测方法。

发明内容

本发明的目的是为了提供一种非洲猪瘟荧光型RAA检测试剂盒，实现非洲猪瘟病毒的快速检测。本发明在检测ASFV的整个过程中，从DNA提取到出现检测结果，只需25min，大大缩短检测时间，提高检测效率。

根据本发明的第一方面，提供一种非洲猪瘟病毒荧光型RAA检测试剂盒，包括特异性引物ASFV-F和ASFV-R，以及标记有THF残基的RAA-exo探针ASFV-P，探针标记的报告荧光染料为FAM，标记的荧光淬灭基团为BHQ-1；其中特异性引物和RAA-exo探针序列如下：

ASFV-F:5′-TCGCCGAAGGGAATGGATACTGAGGGAATA-3′；

ASFV-R:5′-AGGGGATAAAATGACTGGATATAAGCACTTGGT-3′；

ASFV-P:5′-TGCGTATCATTTTCATCGGTAAGAATAGGTT[FAM-dT][THF]C[BHQ1-dT]TTGGTGCGGCTTGTGC-3′。