[发明专利]一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法

说明书

本发明公开了一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，包括：取材及消毒处理：选取当年生青钱柳半木质化带芽茎段和顶端小叶，并做消毒处理：愈伤诱导培养：茎段、叶片于诱导培养基中培养至产生愈伤组织，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃；愈伤增殖培养：将愈伤组织移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃。本发明愈伤组织的诱导和增殖培养置于20℃温度条件下，在保证青钱柳正常生长的前提下抑制了酚类物质产生，同时低温促进了愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

技术领域

本发明涉及一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术

青钱柳[Cyclocarya paliurus(Batal.)Iljinskaja]属双子叶植物纲(Dicotyledoneae)胡桃科(Juglandaceae)青钱柳属(Cyclocarya)植物，其在观赏、药用、材用方面具广阔利用前景。在观赏方面，其树形美且通直，果具圆盘状果翅，远观似铜钱；根系发达，根蘖强，是优良的景观造林树种。在材用方面，其生长速度快，年轮粗细均匀，木材强度高，耐磨损，适作家具、室内装饰和建筑用材。在药用方面，其叶特有的总黄酮、总三萜、总多糖和总酚类化合物，具降血压、降血脂、降血糖、抗氧化和抗PTP1B等功能，并具有改善肾功能、调节血糖紊乱、缓解肝脏损伤、提高免疫功能等生理作用。

目前青钱柳药用活性成分主要从叶片中提取，从愈伤组织中提取的相关报道较少。关于其次生代谢产物的研究主要集中于提取方法的优化、代谢产物分析等方面，随着市场需求量增大，植物提取技术面临有效提取量低、天然资源受限、成本高等问题，其次生代谢产物又受种源、生长条件影响，含量差异明显，故通过愈伤组织进行次生代谢产物生产具有现实意义。青钱柳愈伤组织已被证实含有黄酮类、三萜类和总酚类等化合物，且通过优化培养条件和应用生物反应器可提升产量。愈伤组织培养技术具有增殖效率高、培养成本低、材料生长快等特点，不仅是植物间接快繁的重要步骤，而且在药用植物次生代谢产物生产方面也具有广阔的应用前景。但是，青钱柳愈伤组织在培养过程中容易产生酚类物质，不利于愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，愈伤组织的诱导和增殖培养置于20℃温度条件下，在保证青钱柳正常生长的前提下抑制了酚类物质产生，同时低温促进了愈伤组织的生长和次生代谢产物的积累。

为解决上述技术问题，本发明提供一种促进青钱柳愈伤组织生长和次生代谢产物积累的培养方法，其特征是，包括：

取材及消毒处理：选取当年生青钱柳半木质化带芽茎段和顶端小叶，并做消毒处理：

愈伤诱导培养：茎段、叶片于诱导培养基中培养至产生愈伤组织，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃；

愈伤增殖培养：将愈伤组织移至继代增殖培养基中进行继代增殖培养，用封口膜密封后放入培养室培养，培养条件为连续黑暗处理，培养温度设置于20℃。

进一步地，所述消毒处理的具体方法为：茎段和叶片先经1～2滴洗涤剂浸泡2min，流水冲洗1～2h；茎段在超净工作台上经75％酒精处理30s，随后流水冲洗干净，在5％次氯酸钠溶液中浸泡3～5min，流水冲洗干净备用；叶片在超净工作台上经75％酒精处理10s，随后流水冲洗干净，在5％次氯酸钠溶液中浸泡2～2.5min，流水冲洗干净备用。

进一步地，所述叶片的消毒时间短于茎段，多次冲洗以洗脱消毒剂，茎段消毒后去除首尾两端，叶片消毒后于维管束处划痕。

进一步地，所述取样时间为4月至9月；茎段取自青钱柳无病害枝条顶端1～2节；叶片取自青钱柳复叶上的顶端小叶。