[发明专利]一种运动神经元及其制备方法和应用

说明书

本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种运动神经元及其制备方法和应用。所述运动神经元，其表达OLIG2+、MAP2+和CHAT+，还表达PAX6+、HB9+、ISL1+、Synaptophysin+和Tubulin+中的一种或任意组合。本发明还公开了制备运动神经元的方法，包括以下步骤：多能干细胞向神经上皮细胞分化；神经上皮细胞向运动神经前体细胞分化；运动神经前体细胞向有丝分裂后运动神经元分化；有丝分裂后运动神经元向成熟运动神经元分化，即得到成熟的运动神经元。本发明提供的制备方法未使用含有血清或血清替代物的体系；分化效率高，分化效果稳定；纯化方法简便，获得的细胞纯度高。使用运动神经前体细胞冻存液，成分明确、价格低廉；复苏后细胞活力高(＞80％)，仍保持高效地向成熟运动神经元分化的能力。

技术领域

本发明涉及干细胞生物学领域，尤其涉及一种运动神经元及其制备方法和应用。

背景技术

运动神经元病(motor neuron disease，MND)，是一组病因尚未明确的选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、皮质椎体细胞及椎体束的慢性退行性疾病，其病理特征为进行性上、下运动神经元的变性、坏死及凋亡。由于症状和体征的组合不同，形成不同类型的运动神经元病，包括肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)、原发性侧索硬化(primary lateral sclerosis，PLS)和进行性延髓麻痹(progressive bulbar palsy，PBP)等，其中ALS是慢性运动神经元病的最常见类型，俗称“渐冻人症”。ALS具有两种形式：一种是散发的ALS(sALS)，这是最常见的ALS的形式，并占所有诊断的病例的90-95％；另一种是家族性的ALS(fALS)，这发生在主要具有显性遗传的家族谱系中，占所有诊断的病例的5-10％。其特征在于在初级运动皮质、脑干和脊髓中的运动神经元(MN)的显著损失。运动神经元的损失会破坏基础性的基本动作，诸如呼吸，手、臂、腿或吞咽肌的肌无力，并通常在诊断以后2～5年内造成患者的死亡。针对运动神经元病的治疗，一个策略是基于可以促进神经元存活的神经营养因子(诸如胰岛素-样生长因子I(IGF-I)、神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)、血管内皮生长因子(VEGF)、Colivelin和活性依赖性的神经营养因子(ADNF)衍生的肽的神经保护和/或再生作用。多个研究结果已表明，神经营养因子在SOD1转基因小鼠中可以维持其运动神经元的功能性，因此改善运动表现。但是，这样的治疗并不能延长SOD1小鼠的存活，从而提示，神经营养因子不足以维持神经元存活(Yacila and Sari.,2014)。

运动神经元病的主要病理特征为特定运动神经元的损失，但是大部分运动神经元病的发病机理仍不明确，目前没有治愈的方法。多能干细胞包括胚胎干细胞(embryonicstem cell,ESC)和诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)，具有无限增殖的能力，并且在体外可以分化为几乎所有功能细胞，包括运动神经元。因此，体外通过多能干细胞诱导大规模制备纯度高的运动神经元，对于研究运动神经元病的发生机理、药物筛选、药物毒性测试等方面具有重要意义。

目前已有研究报道了体外诱导人多能干细胞分化为成熟运动神经元的方法，虽然可以成功诱导获得成熟运动神经元，但仍然存在培养时间长、效率低、纯度低等问题。例如，专利文献CN106701824A公开了一种基于iPS细胞获取脊髓运动神经元及其功能性细胞的方法，CN107868772A公开了一种诱导人脊髓运动神经前体细胞分化为脊髓运动神经元的方法)，CN105567636A公开了一种人源脂肪干细胞来源的神经元细胞的制备方法及其应用。