[发明专利]一种细胞表面展示果胶酶的酿酒酵母工程菌、用途和催化剂

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种一种细胞表面展示果胶酶的酿酒酵母工程菌、用途和催化剂。本发明采用基因重组技术将特定的果胶酶基因克隆连接至酿酒酵母表面展示表达载体pYD1，并转化至酿酒酵母菌株EBY100中，得到产酶活性较游离酶酶活更高的重组菌株。同时，实验表明通过优选特定的果胶酶基因并将该基因表面展示在酿酒酵母细胞表面，可以使该酶分泌性能极大提高、酶学性质明显提升，相比较利用本申请以外的果胶酶基因进行细胞表面展示组合来说，采用本发明的方法展示果胶酶显得更加有优势。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及一种一种细胞表面展示果胶酶的酿酒酵母工程菌、用途和催化剂。

背景技术

果胶主要是由D-半乳糖醛酸残基以α-1，4糖苷键连接而形成的复合多聚糖，广泛存在于植物细胞壁中，是仅次于纤维素但又未获得充分利用的可再生资源。果胶酶是能够降解果胶的一类酶的总称(主要包括果胶水解酶、果胶裂解酶、果胶酯酶)，是目前世界四大酶制剂之一，被广泛应用于食品、饲料、医药等工业领域。随着我国消费需求多样性的快速增长，对果胶酶的需求越来越大，但目前使用的果胶酶大部分都是从国外进口的高价酶。主要原因是国内菌种产酶能力和活力比较低，而且纯度不高，大多为粗酶制剂，不适合食品、医药工业的应用，而且酶的制作和储藏技术也不完善。虽然目前国内也在致力于果胶酶工程菌株的构建和改造，但大多数工程菌株为细胞内或分泌游离酶，其产酶效率低，分离纯化比较困难，因而造成产酶成本增加，不利于大规模生产和应用。

酶的固定化一般都是通过物理或化学的方法将游离酶固定于特殊的载上，不仅增强酶的稳定性，同时又能使酶与作用底物分离，达到重复利用，降低成本的目的。但是，传统的物理或化学固定化方法，增加的酶固定化操作会导致酶活性和回收率的损失；另外，固定化需用特殊的载体材料，且对固定化技术要求比较高，因而增加了载体制作和固定化操作的成本费用，被固定的酶需要分离纯化同样增加了生产成本。而近些年发展起来的微生物细胞表面展示技术为酶的固定化提供了一种全新的基于基因重组技术的生物学方法。酿酒酵母一直被认为是安全的模式生物(GRAS)而广泛应用于食品和医药工业，也是目前常见的用于酵母表面展示的宿主细胞。利用细胞表面展示技术将具有高催化活性的酶展示表达于酿酒酵母细胞表面就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面展示的酶是以共价或非共价的方式固定于细胞外表面，这种独特的空间定位使其相对游离酶而言有许多优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复利用等，这些特点与传统的固定化酶技术类似，但无需额外制备载体及固定化、酶蛋白分离纯化等复杂操作，有着巨大的应用前景。然而，异源蛋白过量表达却会导致生长胁迫压力引起未折叠蛋白效应(UPR)，导致果胶酶的产量不能进一步提高，一定程度上限制了果胶酶的工业化生产。

发明内容

针对现有技术存在的果胶酶生产过程中产酶效率低等技术问题，本发明提出了一种细胞表面展示果胶酶的酿酒酵母工程菌、用途和催化剂，使果胶酶在生产的同时实现固定化，果胶酶的空间结构未受其他物理或化学因素破坏，制得的固定化酶活力和产量均显著提高。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的是提供一种细胞表面展示果胶酶的酿酒酵母工程菌，其构建过程包括以下步骤：

(1)获得成熟的果胶酶基因；

(2)连接成熟的果胶酶基因与酿酒酵母表面展示表达载体，得到重组载体；

(3)将步骤(2)得到的重组载体转化入宿主菌株酿酒酵母EBY100中，得到细胞表面展示果胶酶的酿酒酵母工程菌。

进一步地，所述成熟的果胶酶基因选自黑曲霉SC323果胶酶基因pgaA。

更进一步地，所述成熟的果胶酶基因的cDNA序列如SEQ ID NO:6所示。通过优选特定的果胶酶基因并将该基因表面展示在酿酒酵母细胞表面，可以使该果胶酶分泌性能极大提高，酶学性质明显提升。