[发明专利]基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法及试剂盒

权利要求书

1.一种基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)金纳米颗粒的制备；

(2)报告探针HCR扩增；

(3)拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备；

(4)磁珠捕获系统制备；

(5)质粒与报告系统的固定；

所述报告探针HCR扩增的步骤如下：

将2μM SH标记的H1/H2探针各50μL混合均匀后置95℃加热5min后，H1/H2探针序列如SEQ ID:No.3-4所示；室温放置2hr；然后加入0.6μM ASF-HCR-detection probe，ASF-HCR-detection probe的序列如SEQ ID:No.2所示；室温放置2hr后置于4℃保存；

其中，SEQ ID:No.2为ASF-HCR-detection，其序列为：

5’-tggaagggtatgtaagaactaggattcggcgtgggt-3’；

SEQ ID:No.3为H1，其序列为：

5’-acccacgccgaatcctagtgtagtctaggattcggcgtg-3’-HS-C3；

SEQ ID:No.4为H2，其序列为：

HS-C6-5’-actaggattcggcgtgggtcacgccgaatcctagactac-3’。

2.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述金纳米颗粒的制备是根据柠檬酸钠还原法制备实验所用粒径为13nm的金纳米颗粒。

3.根据权利要求2所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述金纳米颗粒的制备步骤如下：将150mL 0.01％氯金酸溶液边搅拌边加热到沸腾，然后迅速加入4.5mL 1％柠檬酸钠溶液；溶液颜色由浅黄色逐渐变成酒红色后，继续加热沸腾15min；撤去热源，慢慢冷却至室温，将制备好的金纳米颗粒溶液置于4℃保存。

4.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述拉曼染料和报告DNA功能化的金纳米颗粒的制备步骤具体如下：

首先，取1mL金纳米颗粒溶液以12000r/min离心10min，去除上层溶液，将底部沉淀重新分散在500μL灭菌水中，然后，加入5μL10mmol/L拉曼染料溶液；

室温放置30min后，加入100μL HCR扩增后的SH-DNA溶液，混合均匀，室温放置10min；然后，每隔5min加入5μL 100mmol/L pH3的Citrate-HCl缓冲液，使其终浓度为10mmol/L；

再加入500mmol/L、pH7.6HEPES缓冲液，将溶液的pH值调回中性，室温培养30min；所得溶液于12000r/min下离心10min，并用5mmol/L pH7.6HEPES缓冲液清洗两次，以充分除去未结合的拉曼染料和DNA；最后，悬浮在500μL 5mmol/LpH7.6的HEPES缓冲液，4℃储存备用。

5.根据权利要求1所述的基于拉曼光谱的非洲猪瘟病毒定性快检方法，其特征在于：所述磁珠捕获系统制备步骤具体如下：

取50μL10μg/μL磁珠于离心管中，加入1mL1×BW缓冲液，轻弹离心管使其混匀，置于磁力架上使磁珠被吸附于离心管侧壁上，吸弃管内液体，重复三次以彻底清洗磁珠表面防腐剂；

将洗净的磁珠重悬于500μL 2×BW缓冲液中，加入500μL10mM捕获探针溶液后，捕获探针的序列如SEQ ID:No.1所示；室温孵育10min，中途轻弹管壁使磁珠于探针混合均匀；

孵育结束后磁力架吸附用1mL1×BW缓冲液清洗磁珠三次，以去除过量未反应的捕获探针；将洗净的磁珠重悬于50μL结合缓冲液中，4℃保存备用；

其中，SEQ ID:No.1为ASF-CAPTURE，其序列为：

5’-acaagatcagccgtagtgatagaaaaaaaaaaa-3’biotin。