[发明专利]细菌膜囊泡及其制备方法与应用

说明书

本发明属于微生物学领域，涉及一种细菌膜囊泡及其制备方法与应用。本发明提供了一种从灭活细菌中分离的膜囊泡。所述灭活细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,以及基因工程菌。本发明还提供了分离和制备方法，以及作为疫苗的应用。本发明首次采用电离射线X射线辐照细菌，分离并纯化其分泌的MVs，制得的MVs可作为疫苗、疫苗佐剂、和药物载体。

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种细菌膜囊泡的制备分离纯化以及该膜囊泡的应用。

背景技术

膜囊泡(MVs，membrane vesicles)是细菌细胞(包括革兰氏阳性菌和阴性菌)外膜分泌的囊泡状结构产物。多数为球形，直径大约20–250nm(Structures of gram-negativecell walls and their derived membrane vesicles/革兰氏阴性菌细胞壁结构及其分泌的膜囊泡)。细菌膜囊泡含有多种生物活性大分子如核酸、脂多糖、外膜蛋白等成分，以及金属离子、酶、信号分子等(Biological functions and biogenesis of secretedbacterial outer membrane vesicles/分泌的细胞外膜囊泡的生物学功能和生物学起源)。它在细菌的多种生命活动中扮演着重要角色，如分泌毒力因子、压力应激反应、营养摄取，及作为细菌间、细菌与宿主细胞间进行信息交流的载体等。

膜囊泡的分泌发生在细菌的任何生长阶段，不同于细胞裂解及凋亡，研究发现在压力刺激、缺氧、抗生素压迫等情况能够促进细菌产生膜囊泡。然而，自然生成的细菌膜囊泡产量低，往往需要培养大量的菌体才能收获一定量的膜囊泡，并且后续还需要额外的纯化工艺才能得到一定质量的膜囊泡。

现代工艺技术在生产制备及纯化细菌膜囊泡时存在以下问题：1)利用抗生素、去污剂、氧化剂等手段虽然能促进膜囊泡分泌，但也伴随着有毒残留问题，给其应用带来了不确定性。2)上述干预因素刺激细菌产生膜囊泡的效率也相对较低，且该制备工艺不能实现标准化生产。3)上述方法会使菌体本身的外膜抗原性、构象等可能发生变化，进而影响囊泡，限制其后续应用。

综上，本发明提供了一种分离细菌MVs的方法，和一种制备细菌MVs的方法。本发明采用国际领先的工艺技术，不添加化学刺激物质，因此无残留物引起不良作用，同时工艺流程简单、囊泡产量高，高效、放大效果好，可以用于囊泡的大量制备。制备的囊泡与正常囊泡相比内毒素含量较低且具有较好的免疫原性，后续进一步的开发应用前景广阔。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种细菌膜囊泡。

为实现上述目的，本发明的技术方案为：

细菌分泌的生物颗粒，其特征在于，所述生物颗粒是从灭活细菌中分离的膜囊泡。

进一步，所述灭活细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和基因工程菌。

进一步，所述革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、链球菌、白喉杆菌、结核杆菌、破伤风杆菌、芽孢杆菌或棒状杆菌。

进一步，所述革兰氏阴性菌包括铜绿假单胞菌、大肠杆菌、伤寒杆菌、脑膜炎双球菌、变形杆菌、志贺菌。

进一步，所述灭活菌为厌氧菌。

进一步，所述厌氧菌包括幽门螺杆菌、反硝化细菌或核梭杆菌。

含有上述生物颗粒的灭活细菌。

进一步，所述灭活细菌与所述作用疫苗和/或疫苗佐剂和/或药物载体的生物颗粒组合。

本发明的目的还在于提供一种膜囊泡的分离方法。

一种从细菌中分离膜囊泡的方法，所述细菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，具体包括以下步骤：

1)将细菌的菌液离心并收集上清液1，