[发明专利]铜绿假单胞菌膜囊泡及其制备方法与应用

说明书

铜绿假单胞菌膜囊泡及其制备方法与应用，本发明属于微生物学领域，本发明提供了一种从灭活铜绿假单胞菌中分离的膜囊泡。本发明还提供了分离和制备方法，以及作为疫苗的应用。以及该细菌疫苗的应用。本发明首次采用电离射线X射线辐照铜绿假单胞菌，分离并纯化其分泌的MVs，制得的MVs可作为疫苗、疫苗佐剂、和药物载体。

技术领域

本发明属于微生物学领域，具体涉及一种铜绿假单胞菌膜囊泡的制备分离纯化以及该膜囊泡的应用。

背景技术

膜囊泡(MVs，membrane vesicles)是细菌细胞（包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌）外膜分泌的囊泡状结构产物。多数为球形，直径大约20–250 nm（Structures of gram-negative cell walls and their derived membrane vesicles/革兰氏阴性菌细胞壁结构及其分泌的膜囊泡）。细菌膜囊泡含有多种生物活性大分子如核酸、脂多糖、外膜蛋白等成分，以及金属离子、酶、信号分子等（Biological functions and biogenesis ofsecreted bacterial outer membrane vesicles/分泌的细胞外膜囊泡的生物学功能和生物学起源）。它在细菌的多种生命活动中扮演着重要角色，如分泌毒力因子、压力应激反应、营养摄取，及作为细菌间、细菌与宿主细胞间进行信息交流的载体等。

膜囊泡的分泌发生在细菌的任何生长阶段，不同于细胞裂解及凋亡，是一条独立的分泌途径，研究发现在压力刺激、缺氧、抗生素压迫等情况能够促进细菌产生膜囊泡。然而，自然生成的膜囊泡产量低，往往需要培养大量的菌体才能收获一定量的膜囊泡，并且后续还需要额外的纯化工艺才能得到一定质量的膜囊泡。

现代工艺技术在生产制备及纯化细菌膜囊泡时存在以下问题：1）利用抗生素、去污剂、氧化剂等手段虽然能促进膜囊泡分泌，但也伴随着有毒残留问题，给其应用带来了不确定性。2）上述干预因素刺激细菌产生膜囊泡的效率也相对较低，且该制备工艺不能实现标准化生产。3）上述方法会使菌体本身的外膜抗原性、构象等可能发生变化，进而影响囊泡，限制其后续应用。

综上，本发明提供了一种分离铜绿假单胞菌MVs的方法，和一种制备铜绿假单胞菌MVs的方法。本发明采用国际领先的工艺技术，不添加化学刺激物质，因此无不良作用，同时工艺流程简单、囊泡产量高，高效、放大效果好，可以用于囊泡的大量制备。制备的囊泡与正常囊泡相比内毒素含量较低且具有较好的免疫原性，后续进一步的开发应用前景广阔。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种铜绿假单胞菌膜囊泡。

为实现上述目的，本发明的技术方案为。

铜绿假单胞菌疫苗，所述铜绿假单胞菌疫苗含有从灭活铜绿假单胞菌中分离的膜囊泡。

含有被分离的膜囊泡的灭活铜绿假单胞菌，及被分离的膜囊泡与灭活铜绿假单胞菌形成组合物。

进一步，为所述灭活铜绿假单胞菌与所述作用疫苗和/或疫苗佐剂和/或药物载体的膜囊泡组合。

本发明的目的还在于提供一种分离铜绿假单胞菌膜囊泡的方法。

一种从铜绿假单胞菌中分离膜囊泡的方法，包括如下步骤：

1）培养细菌至对数生长期然后发酵；

2）收集菌液，将菌液离心并收集上清液，上清液用0.3-0.5μM滤器过滤除菌；

3）将过滤后的上清液用高速离心机离心，收集上清液，去除鞭毛；

4）将去除鞭毛后的上清液用超高速离心机离心，沉淀即得到膜囊泡。

进一步，步骤2）的上清液用0.45μM滤器过滤除菌。

进一步，步骤2）的离心速率为100-10000g；离心时间为10-60min。