[发明专利]一种端粒长度检测试剂盒与方法及生物学年龄评价方法

权利要求书

1.一种用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，包括：

端粒基因引物序列：

正向引物：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT，

反向引物：GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCT；

内参基因引物序列：所述内参基因为β-globin：

正向引物：GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC，

反向引物：CACCAACTTCATCCACGTTCACC。

2.根据权利要求1所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，还包括内部质控标准品及阴性对照，其中阴性对照为去离子水。

3.根据权利要求1所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，还包括用于自动计算生成实验的平均校准因子并计算得到各检测样本的校准T/S值的计算系统。

4.根据权利要求3所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，其内部质控体系的建立及平均校准因子计算方法如下：

a.随机选取5例样本，如D01-D05作为质控品样本，完成至少7次qPCR实验，记录每次实验中的Ct内参及Ct端粒值；

b.计算各质控样本在每次实验中的T/S ratio＝2^{-(Ct端粒-Ct内参)}；

c.计算至少7次实验中各质控品样本T/S ratio平均值，即为各质控样本的T/S标准值；

d.计算每个质控品样本的校准因子：

D01校准因子＝(T/S ratio)/(T/S ratio平均值)；

e.计算某次实验的平均校准因子：5个质控样本校准因子的平均值即为该次实验的平均校准因子；

f.计算实验样本的校准T/S ratio：样本的校准T/S ratio＝(T/S ratio)/该次实验的平均校准因子。

5.根据权利要求4所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，所述内参基因的qPCR反应体系包含：

2× SYBR Green I qPCR Mix 10μL；

内参基因正向引物 0.8μL；

内参基因反向引物 0.8μL；其中，所述内参基因正向引物和内参基因反向引物的浓度均为10μmol/L；

50×ROX Reference DyeII 0.4μL；

H₂O 6μL；

基因组DNA 2μL，其中基因组DNA的浓度为10ng/μL。

6.根据权利要求5所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，所述内参基因的qPCR反应条件如下：

96℃预变性1min；95℃变性15s，58℃退火1s，72℃延伸20s，预扩增循环8次，不采集荧光；96℃变性1s，58℃退火1s，72℃延伸20s，83℃延伸30s，循环35次并在83℃延伸结束后采集荧光；熔解曲线温度区间为60℃-95℃。

7.根据权利要求6所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，所述端粒基因的qPCR反应体系包含：

2× SYBR Green I qPCR Mix 10μL；

端粒基因正向引物 0.8μL；

端粒基因反向引物 0.8μL；其中，端粒基因正向引物和端粒基因反向引物的浓度均为10μmol/L；

50×ROX Reference DyeII 0.4μL；

H₂O 6μL；

基因组DNA 2μL，其中基因组DNA的浓度为10ng/μL。

8.根据权利要求7所述的用于端粒长度检测的试剂盒，其特征在于，所述端粒基因的qPCR反应条件如下：

96℃预变性1min；96℃变性1s，54℃退火及延伸1min，循环30次并采集荧光；熔解曲线温度区间为60℃-95℃。

9.一种基于权利要求4-8任一所述的用于端粒长度检测的试剂盒的生物学年龄评价方法，其特征在于，步骤如下：

(1)依据试剂盒内部质控体系的建立及平均校准因子计算方法，建立中国人口端粒长度检测校准T/S数据库，并绘制校准T/S值-年龄分布图，同时标记5％，10％，25％，50％，75％，90％，95％的数据分布区间；

(2)依据上述端粒长度校准T/S值-年龄模型分布图，拟合算法，建立端粒长度-生物学年龄的算法模型系统；利用该系统进行生物学年龄计算，并给出端粒长度在人群中的分布情况。