[发明专利]一种端粒长度检测试剂盒与方法及生物学年龄评价方法

说明书

本发明公开了一种用于端粒长度检测的试剂盒，包括：端粒基因引物序列，内参基因引物序列，本发明还公开了一种生物学年龄评价方法，步骤如下：(1)建立中国人口端粒长度检测校准T/S数据库；(2)依据上述端粒长度校准T/S值‑年龄模型分布图，拟合算法，建立端粒长度‑生物学年龄的算法模型系统；应用本发明试剂盒采用校准T/S比作为端粒长度评价标准，可实现端粒长度的准确检测及动态评价分析；应用本发明试剂盒可通过提供的生物学年龄数据库及计算模型系统，实现生物学年龄的科学评估；应用本发明试剂盒进行端粒长度检测效果稳定，原料廉价易得，实验操作简单、易行。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种用于端粒长度检测的试剂盒及生物学年龄评价方法。

背景技术

端粒存在于真核细胞染色体末端，是由特异性结合蛋白及高度重复的非转录DNA序列组合而成的一种特殊结构。端粒DNA由两条链构成，一条为3′-5′方向的C链(AATCCC)，另一条为5′-3′方向的G链(TTAGGG)。除C-G链互补部分外，G链末端较C链长出50-300nt，尾部长出的部分会回折插入端粒互补序列中与C链结合，置换出部分G链，形成D-loop与T-loop结构。端粒结构稳定，如同染色体的帽子存在于染色体两端，保护染色体不被核酸酶降解，防止末端融合，对于维持基因组信息的完整与稳定有重要意义。

端粒长度会随每次复制而逐渐变短，直到端粒末端消耗殆尽，细胞激活凋亡机制，逐渐走向凋亡。端粒的存在对于保护遗传物质中的关键信息有重要的缓冲作用。端粒长度能反应复制潜能，是细胞持续分裂的前提条件；分裂次数越多，端粒磨损越多，细胞寿命越短。

端粒长度与细胞老化状态及疾病情况密切相关。研究显示，衰老细胞中的端粒长度较正常细胞偏短；罹患心脑血管疾病、糖尿病等部分疾病的患者，端粒长度较正常人偏短。端粒长度的检测，对于揭示细胞衰老状态、评价健康状况、预防疾病，有十分重要的意义。

目前，常用的端粒长度检测方法主要包括：端粒末端限制性片段分析(TRF)、荧光定量PCR(qPCR)、定量荧光原位杂交(Q-FISH)、流式荧光原位杂交(Flow FISH)、单个端粒长度分析(STELA)、全基因组测序(WGS)等。

其中，TRF方法通过限制性内切酶消化基因组DNA而端粒片段不会被切割，消化产物通过Southern blotting方法检测端粒长度。但此方法DNA用量大，受端粒与探针结合效率限制，且对提取DNA的完整性要求较高，需避免样本反复冻融及被核酶污染降解。Q-FISH与FLOW FISH均采用荧光标记探针(CCCTAA)3与细胞悬液杂交，通过检测端粒荧光信号进行端粒长度分析。其中，FLOW FISH技术通过流式细胞仪进行端粒荧光信号分析，能精确获得每个细胞的平均端粒长度，敏感性、重复性较好。但此方法对于要求细胞核结构完整、对于设备及技术要求较高、检测成本较高。STELA基于单分子PCR技术原理，适用于微量DNA的端粒长度检测，可检测单个染色体末端端粒长度改变，但对于技术要求较高。WGS方法对于实验操作及后期数据分析要求均较高，且测序价格昂贵。

qPCR方法因具备DNA用量少，操作简单、仪器设备易得等优点，特别适用于端粒长度的检测分析。现有的qPCR方法通过设计引物，扩增端粒基因片段与内参基因片段，通过T/S比值来计算端粒相对长度。实验中，由于不同人员、或使用不同批次试剂进行操作，会造成检测结果的批间差异，很难做到对端粒长度的持续动态监测与准确对比分析。

发明内容

本发明的实施例目的在于提供一种用于端粒长度检测的试剂盒及生物学年龄评价方法，以解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

一种用于端粒长度检测的试剂盒，包括：

端粒基因引物序列：

正向引物：CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT，