[发明专利]同时准确定量分析人血浆维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒

权利要求书

1.柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和市售K₂EDTA抗凝真空采血管在保持人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物稳定性中的应用，其中所述的维卡格雷主要代谢产物是指其中间代谢产物2-oxo-clopidogrel和硫醇活性代谢产物H4。

2.一种稳定人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的方法，所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4，其特征在于该方法包括向人全血或血浆中加入柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K₂EDTA。

3.柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K₂EDTA在制备同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒中的应用，其中所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4。

4.一种同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含柠檬酸、氟化钠和2-溴-3’-甲氧基苯乙酮；或者包含柠檬酸、氟化钠、2-溴-3’-甲氧基苯乙酮和K₂EDTA抗凝真空采血管。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于所述的试剂盒包含：

对照品溶液A：维卡格雷：8μg/mL

对照品溶液B：2-oxo-clopidogrel：8μg/mL

对照品溶液C：MP-H4：30μg/mL

内标IS溶液：氯吡格雷：300ng/mL

稳定剂A：柠檬酸溶液：5M

稳定剂B：氟化钠溶液：1M

稳定剂C：2-溴-3’-甲氧基苯乙酮溶液：500mM

校准品稀释液：稳定化人空白血浆，通过以下方法制备：将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K₂EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中，充分混合后，4000rpm离心10min分离所得血浆，即为稳定化人空白血浆；其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100；所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100；所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50；

流动相添加剂：甲酸

K₂EDTA抗凝真空采血管；

或者包含：

对照品溶液A：维卡格雷：8μg/mL

对照品溶液B：2-oxo-clopidogrel：8μg/mL

对照品溶液C：MP-H4：30μg/mL

内标IS溶液：氯吡格雷：300ng/mL

稳定剂A：柠檬酸溶液：5M

稳定剂B：氟化钠溶液：1M

稳定剂C：2-溴-3’-甲氧基苯乙酮溶液：500mM

校准品稀释液：稳定化人空白血浆，通过以下方法制备：将稳定剂A、稳定剂B和稳定剂C加入到K₂EDTA抗凝的、新鲜的人空白全血中，充分混合后，4000rpm离心10min分离所得血浆，即为稳定化人空白血浆；其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100；所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100；所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50；

流动相添加剂：甲酸。

6.权利要求4-5中任一项所述的试剂盒在同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物中的应用，其中所述的维卡格雷主要代谢产物为2-oxo-clopidogrel和H4。

7.一种同时定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的方法，其特征在于包含以下步骤：

A.全血收集与血浆制备：

1)依次将权利要求5中所述的稳定剂A、稳定剂B、稳定剂C注入K₂EDTA抗凝真空采血管内，注意不要破坏其真空；其中所述的稳定剂A与所述的人空白全血的体积比为1:100；所述的稳定剂B与所述的人空白全血的体积比为1:100；所述的稳定剂C与所述的人空白全血的体积比为1:50；

2)收集全血至采血管刻度线，立即颠倒混匀，4℃，4000rpm离心10min，分离血浆于-80℃保存待测；

B.内标工作液与流动相配制：

1)内标工作液的制备：按测试量移取所需量的内标溶液，按照内标溶液：乙腈＝1:99混匀，配制成内标工作液，备用；

2)流动相的配制：量取500mL超纯水至试剂瓶中，再加入500μL流动相添加剂甲酸，制备成流动相A；量取500mL乙腈至试剂瓶中，再加入500μL流动相添加剂甲酸，制备成流动相B；分别涡旋混合1min后超声10min脱气；

C.标准曲线和质控样品的制备：

1)将对照品溶液A用校准品稀释液依次梯度稀释至维卡格雷浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1、0.05ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线，并制备维卡格雷浓度为60、10、0.1ng/mL高、中、低三个浓度质控样品；

2)将对照品溶液B用校准品稀释液依次梯度稀释至2-oxo-clopidogrel浓度为80.0、60.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线，并制备2-oxo-clopidogrel浓度为2-oxo-clopidogrel 60、20、0.5ng/mL高、中、低三个浓度质控样品；

3)将对照品溶液C用校准品稀释液依次梯度稀释至H4衍生物MP-H4浓度为300.0、200.0、100.0、50.0、10.0、5.0、2.0、1.0、0.5、0.2ng/mL浓度校准品用于建立标准曲线，并制备MP-H4浓度为200、50、0.5ng/mL高、中、低三个浓度质控样品；

D.样品处理：

1)将待测血浆样本至冰上融化并混匀；

2)取50μL血浆样品，包括定量校准品、质控品、待测样本于2mL离心管中，加入200μL内标工作液，涡旋3min，4℃，12,000rpm离心20min，取50μL上清至进样瓶中；

E.上机检测：

1)上机检测选用Shimadzu LC-30A超高效液相色谱-Sciex Triple Quad^TM4500三重四极杆质谱仪和Agilent Poroshell 120EC-C18，规格：50×2.1mm，1.9μm色谱柱及配套保护柱；

2)设置流动相流速为0.3mL/min，洗脱梯度如下表：

3)柱温设置为40℃，自动进样器温度设置为4℃，进样量设置为2μL；

4)质谱检测选用电喷雾离子化正离子扫描方式，离子喷雾电压为5500V，离子源温度为550℃，气帘气为35Psi，碰撞气为8Psi，喷雾气为40Psi，辅助加热气为45Psi；

5)离子检测方式选择多反应监测，各化合物检测离子对及其检测条件如下表：

6)取处理好的定量校准品、质控品和待测样本溶液注入高效液相色谱-串联质谱仪进行检测，并记录色谱图与待测样本各目标化合物峰面积和内标峰面积；

7)根据标准曲线和各待测样品目标化合物峰面积与内标峰面积比值计算质控品和待测样本的目标化合物浓度。