[发明专利]同时准确定量分析人血浆维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒

说明书

本发明公开了同时准确定量分析人血浆维卡格雷原药及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒。一种同时准确定量检测人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的试剂盒，其特征在于该试剂盒包含柠檬酸、氟化钠和2‑溴‑3’‑甲氧基苯乙酮；或者包含柠檬酸、氟化钠、2‑溴‑3’‑甲氧基苯乙酮和K₂EDTA抗凝真空采血管。本发明提供了一种维持人全血或血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的稳定性的优化方案，并提供了一种可同时准确定量分析人血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法。该检测方法的最低定量限、专属性、回收率和基质效应、精密度和准确度、稳定性和残留效应均符合生物样品检测的规范要求，表明该方法具有良好的准确性和重复性。

技术领域

本发明属于生物检测领域，涉及同时准确定量分析人血浆维卡格雷原药及其主要代谢产物的检测方法及其试剂盒。

背景技术

氯吡格雷(clopidogrel)是一种广泛用于急性冠状动脉综合征(acute coronarysyndrome，ACS)或经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)植入支架后预防冠脉血栓事件的抗血小板药物。然而，大量临床研究发现，在服用常规剂量的氯吡格雷后，仍有一部分患者不能获得预期的抗血小板效应，表现为对氯吡格雷的低反应或无反应，严重的可致血栓、缺血等不良事件，这一现象被称为“氯吡格雷抵抗(clopidogrelresistance，CR)”。

维卡格雷(vicagrel)作为氯吡格雷醋酸酯类似物，是一种旨在克服CR的新型抗血小板药物。如图1所示，维卡格雷主要通过肠道羧酸酯酶(carboxylesterase，CES)2和芳基乙酰胺脱乙酰酶(arylacetamide deacetylase,AADAC)快速水解转化为其中间代谢产物2-oxo-clopidogrel，后者经细胞色素P450(cytochrome P450，CYP或P450)催化生成活性硫醇代谢物(active thiol metabolite)而发挥其抗血小板作用。该代谢途径避开了氯吡格雷依赖于P450催化的第一步氧化代谢，可显著地减少因CYP2C19基因多态性所致CR。同时，临床研究表明，维卡格雷的抗血小板作用显著高于氯吡格雷，一定程度上可克服CR。

活性硫醇代谢物含四种异构体即H1、H2、H3、H4，其中H4是维卡格雷发挥其抗血小板作用的独特硫醇活性代谢物异构体。由于H4化学结构中含有巯基，在血浆中高度不稳定，以往有文献报道，在血液收集过程中使用烷基化试剂2-溴-3’-甲氧基苯乙酮(2-bromo-3’-methoxyacetophenone，MPB)将H4衍生化为MP-H4(已知化学结构，市售商品)可延缓其降解。2-oxo-clopidogrel作为活性硫醇代谢物H4的前体，其准确定量分析有助于估计维卡格雷的口服吸收率。已有文献报道在收集的血浆中加入乙酸可稳定2-oxo-clopidogrel，但未能避免血液收集过程中待测物的降解；另有文献报道使用还原剂1,4-二硫代-DL-苏糖醇(1,4-dithio-DL-threitol，DTT)可维持人血中2-oxo-clopidogrel的稳定性，但考虑到DTT与MPB可能发生相互作用，显然该方法不能同时定量2-oxo-clopidogrel和H4。

维卡格雷作为一种含酯前药，可被血液中广泛存在的各种酯酶(esterases)或水解酶(hydrolases)迅速水解，这不仅导致无法准确定量分析维卡格雷，还可能导致2-oxo-clopidogrel和H4的实测值高于理论值。为了准确分析维卡格雷在人体内的代谢活化过程以指导临床精准用药，在血液样品收集、储存和处理过程中保证维卡格雷、2-oxo-clopidogrel和H4的稳定性，同时准确定量分析它们的血浓度显得尤为重要(图2)。然而，稳定全血或血浆中维卡格雷的优化方法以及可同时检测人血浆中上述三种化合物的方法尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有相关技术的上述不足，提供一种可通过维持维卡格雷及其主要代谢产物的稳定性而同时准确定量分析人血浆中维卡格雷及其主要代谢产物的检测方法。