[发明专利]抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗

说明书

本发明公开了一种抗病原体感染用靶向免疫检查点PD‑L1的融合疫苗；是将PD‑L1Igv样结构域与Pro的C‑末端融合，命名为Pro‑PDL1E。本发明具有以下优点：Pro‑PDL1E诱导得到PD‑L1特异性抗体，并实现在体外阻断PD‑L1和PD‑1结合；Pro‑PDL1E减轻了小鼠模型中巴贝斯虫(Babesia microti)的负担，降低了T细胞上的PD‑1表达；基于HE染色结果，Pro‑PDL1E疫苗未引起明显的组织损伤。并且，本发明提供的靶向免疫检查点PD‑L1的疫苗设计策略，可用于其他自体免疫检查点靶向疫苗的设计，是一种潜力巨大的动物疫苗设计和佐剂开发的有价值的策略。

技术领域

本发明属于疫苗技术领域，具体涉及一种抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗。

背景技术

巴贝斯虫是经蜱吸血传播从而寄生于大小型动物包括人类红细胞中的一类原虫。人的感染病例近年来达到上千例，且呈全球性分布，包括英、法、美、德、瑞士、瑞典、西班牙、芬兰、墨西哥和爱尔兰等国。在我国内蒙古、新疆、黑龙江、浙江、山东和云南等地已发现70多个人的巴贝斯虫感染病例。目前有4种巴贝斯虫及3个未鉴定种可感染人，包括田鼠巴贝斯虫(Babesia mircoti)、分歧巴贝斯虫(B.divergens)、杜氏巴贝斯虫(B.duncani)和猎户巴贝斯虫(B.venatorum)。其中，田鼠巴贝斯虫是引起人类疾病的主要虫种。现在人和动物的巴贝斯虫病主要依靠药物治疗，如奎宁和氯林可霉素等，但这些药物均产生一系列副作用，动物用药则因代谢缓慢而产生药物残留问题。截止目前还没有有效的疫苗对此原虫病进行预防。

慢性感染(如巴贝斯虫感染)、持续的抗原刺激以及肿瘤可诱发炎症反应，从而激活一系列免疫信号。此免疫应答受到正反馈和负反馈调节，两者共同维护免疫系统的平衡。其中负反馈调节相关信号中，以B7家族PD-L1/PD-1和CTL-4所在的信号通路为主要代表。多篇文献报道PD-L1/PD-1和CTLA-4所在的信号通路，在多种病原体的发生发展过程起到免疫抑制作用，阻断这些抑制信号可以显著增强机体的免疫应答，促进机体对病原体的清除。研究表明，治疗性单抗PD-L1的应用可提高机体血液中疟原虫的清除能力。由此推测，阻断PD-L1/PD-1信号通路也可能是治疗巴贝斯虫病的有效策略。但是单抗价格高昂，PD-L1等免疫检查点单克隆抗体很少用于病原体相关疾病的预防和控制，并且预先存在的PD-L1特异性抗体的作用尚不清楚。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗病原体感染用靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗。本发明设计了一种靶向PD-L1的疫苗，是将PD-L1 Igv样结构域与Pro的C-末端融合，命名为Pro-PDL1E，并以此为疫苗。通过主动免疫诱导机体PD-L1特异性免疫应答，评价其在田鼠巴贝斯虫感染小鼠模型中的保护效果及作用机制。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明涉及一种靶向免疫检查点PD-L1的融合疫苗，将PD-L1 Igv样结构域与巴贝斯虫基因Profilin的C-末端融合制得重组蛋白Pro-PDL1E，即所述疫苗。

所述巴贝斯虫基因Profilin的C-末端序列的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

所述PD-L1 Igv样结构域的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，蛋白序列如SEQ ID NO.4所示。

所述融合包括如下步骤：

S1、巴贝斯虫基因Profilin的C末端与PD-L1的细胞外IgV样结构域通过linker(GGGS)3进行连接，构成Pro-PDL1E融合序列(此全序列的DNA片段由生工生物工程上海(股份)有限公司合成)，并连接到pMD-18T载体；

S2、以步骤S1构建于pMD-18T载体的Pro-PDL1E融合片段为模板，通过PCR与酶切酶连将融合片段插入载体pGEX-6p-1，形成带GST标签的Pro-PDL1E重组质粒；