[发明专利]解脲脲原体的检测方法及试剂盒

说明书

本发明提供了一种解脲脲原体的检测方法和试剂盒，所述检测方法包括以下步骤：(1)提取样本的DNA并测定DNA浓度；(2)稀释后，使用ddPCR检测目的基因uif的拷贝数。所述检测试剂盒包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的引物，SEQ ID NO.3的探针，所述探针标记有荧光。本发明所述解脲脲原体的检测试剂盒和检测方具有特异性好、检出率高、假阳性少、可进行绝对定量分析的优点。

技术领域

本发明涉及微生物检测，具体涉及一种解脲脲原体的检测方法及试剂盒。

背景技术

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum，UU)属于柔膜体纲，脲原体属(血清型2、4、5、7-13)，是一类无细胞壁、呈高度多形性、可通过除菌滤器、在无生命培养基中能生长繁殖的最小原核细胞型微生物[1]，是女性泌尿生殖道常见的定植微生物之一，文献报道，新生儿发生UU垂直传播的比例45-66％，早产儿更高。

UU可通过生殖道上行感染、经胎盘血行感染等途径引起围产儿宫内感染，导致早产、宫内生长迟缓、宫内肺炎、支气管肺发育不良、围生儿死亡等不良妊娠结局。很多不明原因的早产均因UU感染所致。Ho Seon Eun等学者研究报道，早产儿UU感染与BPD相关，尤其与中重度BPD的形成相关[3-4]。因此，提高UU检出率及对确诊患儿经治疗后UU核酸的拷贝数水平变化，对了解早产儿UU阳性与BPD的关系，评估UU感染治疗疗效提供临床理论依据。针对上述现状，有必要开展对于UU病原菌的研究，建立UU的新一代检测技术是急需解决的问题之一。

目前对于UU的检测主要依赖培养法和荧光定量PCR(qPCR)法。微生物培养鉴定是UU检测的金标准。但微生物培养的假阴性率高，培养周期长(5-7天)，因此目前普遍使用荧光定量PCR法检测UU。尽管相比微生物培养法，qPCR检测时间明显缩短，但因qPCR中样本的原始Ct值必须依赖外部参照，建立标准曲线，因此标准品的可靠性和重复性严重影响未知样品的定量结果的重复性和可靠性，例如，标准品可因为不同制备流程或储存的过程中发生降解而导致待检样品浓度发生严重偏离；另外，由于qPCR检测未知样品时需借助标准曲线才能对进行定量分析，当模板浓度极低时，qPCR的扩增效率会因为qPCR反应中引物和探针与聚合酶在与模板的目标序列的结合概率的减少而降低，因此商品化的qPCR临床检测试剂盒均以Ct≤30(约1000copies/20μl反应体系)作为阳性结果，极大的降低了病原菌的检出率；同时样本或检测体系的胆红素、盐类等杂质可影响检测结果。

微滴式数字PCR(droplet digital PCR System，ddPCR)是在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，含有待检核酸靶分子的微滴产生荧光信号，不含待检核酸靶分子的微滴不产生荧光信号。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检核酸靶分子的起始浓度或拷贝数。

与传统PCR相比，ddPCR所具有的优势是不依赖Ct值或内参基因却可确定低至单拷贝的待检靶分子的绝对数目。微滴技术让数字PCR更低成本，且更实用，ddPCR消除了对定量标准曲线的依赖，提高了对扩增抑制物的耐受能力。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种特异性好、检出率高、可进行定量分析的解脲脲原体的检测试剂盒。

一种解脲脲原体的检测试剂盒，包括针对uif基因的引物和探针，所述引物为SEQID NO.1和SEQ ID NO.2，探针为SEQ ID NO.3，所述探针标记有荧光。

在其中一些实施例中，还包括阴性质控，所述阴性质控为灭菌生理盐水。

在其中一些实施例中，还包括阳性对照，所述阳性对照为解脲脲原体cDNA模板。

在其中一些实施例中，还包括所述数字PCR反应缓冲液，热启动Taq酶和UNG酶。