[发明专利]一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法有效
| 申请号： | 201910783787.6 | 申请日： | 2019-08-23 |
| 公开（公告）号： | CN110484495B | 公开（公告）日： | 2021-03-09 |
| 发明（设计）人： | 丁磊;熊刘留;周紫晔;崔萌;王全明;邬敏辰 | 申请（专利权）人： | 江南大学 |
| 主分类号： | C12N5/077 | 分类号： | C12N5/077 |
| 代理公司： | 无锡市大为专利商标事务所(普通合伙) 32104 | 代理人： | 殷红梅;张仕婷 |
| 地址： | 214122 江苏*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 老年 人体 关节 软骨 分离 培养 细胞 方法 | ||
1.一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是步骤如下：
（1）取样：取软骨标本，全程无菌冷藏；对软骨标本进行切割，得到直径小于0.5 cm组织片；
（2）第一步降解：将步骤（1）所得软骨组织片在无菌飞旋瓶内，使用重量/体积比为0.4%的Pronase E进行细胞外基质蛋白质的第一步降解，反应在细胞培养箱内进行90分钟；反应条件为：37℃，5% CO2，100%湿度；
（3）第二步降解：将步骤（2）所得降解后软骨组织片采用0.02% collagenase IA进行细胞外基质蛋白质的第二步降解，反应在细胞培养箱内进行16-20小时；反应条件为：37℃，5%CO2，100%湿度；
（4）后处理：将步骤（3）所得降解液，即软骨细胞悬液，使用细胞筛过滤除去未消化组织或细胞团，随后室温800-1000 rpm低速离心8-10分钟后，得到软骨细胞；进行细胞计数及活细胞比率计算；
（5）接种：将步骤（4）分离出得软骨细胞接种于DMEM/F12细胞培养液进行原代培养，接种密度为2 – 4× 105 cells/cm2；
所述软骨标本具体为老年人体下肢负重滑膜关节的标本。
2.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（2）所述Pronase E为使用无菌DMEM/F12配制的Pronase E ，即Protease XIV fromStreptomyces griseus酶溶液。
3.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（3）所述Collagenase IA为使用无菌DMEM/F12配制的Collagenase IA from Clostridiumhistolyticum溶液。
4.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（2）和步骤（3）降解时，反应体系转子转速为匀速70-90 rpm。
5.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（4）所述细胞筛的孔径为40-70 μm。
6.如权利要求1所述从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，其特征是：步骤（5）中DMEM/F12细胞培养液中含有10%胎牛血清、1%青链双抗。
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