[发明专利]一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法

说明书

本发明涉及一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，属于人体组织工程技术领域。其从老年关节软骨中获取大量且具有代谢活性的细胞，应用于临床自体软骨细胞移植修复软骨组织缺损和软骨退行性病变的分子病理与生物治疗基础研究。本发明所阐述的软骨细胞分离方法，结合机械切割与酶解软骨组织，在高温高压灭菌的组织分解瓶（Spinner flask）和细胞培养箱中，使软骨碎片与可降解软骨细胞外基质蛋白特异蛋白酶充分接触，达到完全溶解基质最大程度释放软骨细胞的目的。本发明相较于现有的人负重滑膜关节软骨细胞分离方法，软骨细胞的产量更高，活软骨细胞的比例更大，污染几率更低。

技术领域

本发明涉及一种人体细胞原代培养技术，具体涉及一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，属于人体组织工程技术领域。

背景技术

人体骨骼的负重关节，如髋、膝、踝关节，是由关节囊包裹关节面、关节腔形成的、可在一定范围内进行伸、屈、旋转活动的滑膜关节。覆盖于该类型关节面表面的软骨组织，因含有丰富的二型胶原蛋白纤维（Type II collagen fibers）和能够吸附大量水分子的蛋白聚糖（Proteoglycans），具有很好的缓解、吸收机械压力的作用。然而，软骨组织因不含血管，细胞所需营养来自关节腔中的滑液，依靠关节运动所产生的挤压力摄取营养物质，所以一旦关节损伤发生，运动受限，软骨细胞摄取营养障碍，受损软骨组织则很难自愈。更加严重的是，因受损软骨组织中的细胞代谢发生异常，导致组织呈不可逆降解直至完全消失，形成晚期骨关节炎所表现出的关节疼痛、僵硬、乃至关节功能完全丧失。

不同于人体中以细胞为主体的组织类型，软骨组织中的细胞外基质为主要成分，而软骨细胞（Chondrocytes）作为组织中唯一的细胞类型，在成熟软骨组织内，每个软骨细胞嵌入由自身制造分泌的、主要由胶原纤维与蛋白聚糖形成的软骨小窝（Lacuna）内，分散分布于整个软骨组织。针对于骨关节炎发病机制的研究和使用自体细胞进行软骨缺损修补的自体软骨细胞移植手术（Autologous chondrocyte implant surgery），均需要从软骨组织中分离出软骨细胞，并进行体外培养。由于软骨组织的这种细胞外基质为主体、细胞个体分散分布的组织学特征，如何最大限度地将软骨细胞从丰富得细胞外基质中释放出来，同时保持细胞的整性和代谢活性，是亟需解决的一个难题。

根据文献报道，目前使用的滑膜关节软骨细胞分离方法主要为两种：1）胰蛋白酶、二型胶原蛋白酶顺序酶解法；2）二型胶原蛋白酶酶解法。胰蛋白酶是一种中性丝氨酸蛋白酶，可水解肽链中精氨酸（Arg）或赖氨酸（Lys）羧基端的肽键，但是对于软骨细胞细胞外基质中大量的蛋白聚糖的核心蛋白和二型胶原蛋白肽链的水解作用较弱，而二型胶原蛋白酶虽然含较高的溶组织梭菌蛋白酶B和胰蛋白酶活性，但因两种酶对底物的要求接近，故仍不可达到最大程度破坏二型胶原蛋白三螺旋结构肽链的目的，不能够最大程度地释放被胶原纤维和蛋白聚糖所包裹得软骨细胞。而且，根据文献所报道的数据与我们的实验数据的对比结果，这两种酶解软骨的方法亦存在所分离出的软骨细胞活性较低的缺陷。

发明内容

本发明的目的是针对目前滑膜关节软骨细胞分离培养方法存在细胞产量低、活性低的问题，提供一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，能够有效促进分离出的软骨细胞在培养器皿中以单层贴壁生长的方式进行体外增殖。

本发明的技术方案，一种从老年人体滑膜关节软骨分离培养细胞的方法，步骤如下：

（1）取样：取软骨标本，全程无菌冷藏；对软骨标本进行切割，得到直径小于0.5cm组织片；

（2）第一步降解：将步骤（1）所得软骨组织片在无菌飞旋瓶内，使用重量/体积比为0.4%的Pronase E进行细胞外基质蛋白质的第一步降解，反应在细胞培养箱内进行90分钟；反应条件为：37℃，5% CO₂，100%湿度；