[发明专利]一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法

权利要求书

1.一种基于构型变化的自组装体探针，其特征在于：所述自组装体探针包括核酸适配体探针、G4 DNA和Blocker DNA；

所述核酸适配体探针序列如SEQ ID NO.1所示、G4 DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

所述Blocker DNA序列为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中的任一项所示。

2.根据权利要求1所述的基于构型变化的自组装体探针，其特征在于：所述BlockerDNA序列如SEQ ID NO.5所示。

3.权利要求1-2任一项所述的自组装体探针用于非疾病诊断或治疗为目的的外泌体的无标记检测方法，其特征在于：所述自组装体探针基于核酸适体探针对外泌体膜蛋白的特异性识别能力和DNA链置换反应，改变核酸适体探针构型，释放出触发链，触发链与G-R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM再嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。

4.根据权利要求3所述的无标记检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）外泌体的分离：首先用无外泌体的10%的胎牛血清对所需细胞进行培养，当细胞生长至80-90%，收集上清培养基，在4℃下以3000 × g离心30min，随后过0.22 μm滤膜以去除细胞碎片，收集的滤液经100 KDa MWCO在5000 × g、4℃条件下离心30min，弃上清、将沉淀重悬于磷酸盐缓冲液中，获得外泌体样品溶液；

（2）将G-4 DNA和blocker-DNA在磷酸盐缓冲液中进行预杂交，得到具有粘性末端的G-RDNA溶液；

（3）步骤（1）的外泌体样品溶液在4℃下与核酸适配体探针DNA溶液一起温育1.5h，得到待激活的DNA溶液；

（4）将步骤（2）的G-R DNA溶液与NMM溶液混合后加入到步骤（3）的待激活的DNA溶液中，在0-25℃下反应60-120min，然后进行荧光检测。

5.根据权利要求4所述的无标记检测方法，其特征在于：所述磷酸盐缓冲液为溶剂，磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.4。

6.根据权利要求4所述的无标记检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中G-4 DNA和blocker-DNA在磷酸盐缓冲液中的浓度均为1μM；预杂交的条件为：以1℃min^-1的速率从95℃冷却至4℃。

7.根据权利要求4所述的无标记检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中核酸适配体探针DNA溶液的物质的量浓度为150nM。

8.根据权利要求4所述的无标记检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中G-R DNA溶液、NMM溶液以及步骤（3）的待激活的DNA溶液的终体积为100 μL，其中G-R DNA溶液的反应浓度为100nM，NMM溶液的反应浓度为1μM。