[发明专利]一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法

说明书

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是指一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法。当存在外泌体时，外泌体表面标志物，蛋白酪氨酸激酶‑7（PTK7）与核酸适体特异性结合，改变识别探针构型，释放出触发链，从而与G‑R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。在优化的实验条件下，线性范围为5×10⁵到5×10⁷particles/μL，最低检测限为3.4×10⁵ particles/μL，该探针用于制备用于检测实际血液样品中外泌体的高灵敏和高选择性检测的试剂盒。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别是指一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法。

背景技术

外泌体是直径在30nm到150nm之间的膜结合纳米囊泡 。它们携带大量蛋白质、脂类、DNA、RNA等生物分子，使得外泌体可作为一种非侵害的癌症标志物用于肿瘤的早期诊断试剂的制备。因此，准确定量和分类肿瘤外泌体对癌症诊断、预后评估试剂的制备具有重要意义。

现有的不同方法检测外泌体的性能分析总结见下表：

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专利CN201811548979.0公开了一种基于适配体与滚环扩增的外泌体检测方法，应用电化学传感器的方法构建出基于外泌体特异性的适配体探针，利用G-四联体-Hemin模拟过氧化酶催化H₂O₂反应产生信号；该专利通过滚环扩增合成大量G-四联体进行信号放大，实现外泌体的定量检测；专利CN201811173676.5提供了一种检测外泌体的适配体组、侧流式适配体生物传感器及其制备方法，该专利检测外泌体的适配体组包括CD63适配体和EpCam适配体，CD63适配体能特异性与外泌体的CD63蛋白结合，EpCam适配体能特异性与外泌体的EPCAM蛋白结合，该发明还提供侧流式适配体生物传感器，主要基于层析试纸条原理将CD63适配体喷涂于结合垫上，将EpCam适配体喷涂形成检测线上，质控线上喷涂有能与纳米金标记的适配体的DNA探针通过碱基互补配对结合；通过侧流式适配体生物传感器实现对外泌体定性和定量检测；现有的关于外泌体的检测多是基于外泌体表面通用蛋白CD63的抗体或者核酸适配体直接与外泌体结合形成，这将会产生很高的背景干扰，另外他们大多需要标记信号分子，这无疑将影响识别的效率，所以发展一种可激活的，免标记的荧光传感平台对外泌体进行检测迫在眉睫。

发明内容

本发明提出一种基于构型变化的自组装体探针及其用于外泌体的无标记检测方法，当存在外泌体时，外泌体表面标志物，蛋白酪氨酸激酶-7（PTK7）与核酸适体特异性结合，改变识别探针构型，释放出触发链，从而与G-R DNA发生链置换反应，暴露出富G序列从而形成G四链体，NMM嵌入G四链体，产生较强的荧光信号，实现对外泌体的无标记灵敏检测。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种基于构型变化的自组装体探针，所述自组装体探针包括核酸适配体探针、G4DNA和Blocker DNA。

所述核酸适配体探针序列如SEQ ID NO.1所示、G4 DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

所述Blocker DNA序列为如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10中的任一项所示。

所述Blocker DNA序列如SEQ ID NO.5所示。