[发明专利]一种VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的识别模型、构建方法及应用

说明书

本发明涉及一种VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的识别模型、构建方法及应用，通过MALDI‑TOF MS对VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的质谱蛋白特征峰进行分析，建立区分两种亚型的识别模型；通过该识别模型可快速准确地鉴别VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌，具有操作简便，耗时短等优点，因此，这为MALDI‑TOF MS鉴定细菌亚型的研究提供了全新的思路，具备非常广的应用前景。

技术领域

本发明属于临床微生物检验技术领域，涉及一种VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的识别模型、构建方法及应用。

背景技术

MALDI-TOF MS是近年来飞速发展起来的一种新型微生物鉴定技术，目前已逐渐应用于临床微生物实验室中，它可以通过比较细菌特异性核糖体蛋白、核酸结合蛋白、热休克蛋白等保守蛋白以及其它含量较高的管家基因蛋白等质谱峰的差异，可对病原菌不同的亚型进行区分，具有操作简便、检测快速准确、高通量等优点；但法国生物梅里埃公司推出的VITEK MS数据库尚不能对金属酶铜绿假单胞菌亚型进行鉴定。

目前实验室主要使用亚胺培南EDTA双纸片协同实验对其进行金属酶表型初筛试验，还可以通过金属酶基因PCR扩增及序列分析对产金属酶铜绿假单胞菌的VIM型和SPM型基因进行分型鉴定。基于分子流行病学的研究可明确VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的流行情况和变化趋势，为铜绿假单胞菌耐药机制的研究和感染控制提供科学的依据。但此类方法同样存在耗时较长，操作复杂，易污染，不适用于临床快速检测等缺点。因此，亟待研究一种能快速、准确地检测VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的新方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌的识别模型、构建方法及应用。

1、一种VIM型和SPM型金属酶铜绿假单胞菌识别模型的构建方法，具体步骤如下：

(1)首先将VIM型和SPM型菌株质谱结果导入SARAMIS数据库，通过对两者质谱峰进行聚类分析，发现两者之间存在部分有差异的质谱峰；然后通过LaunchPad软件将两者质谱峰进行比较分析，得到17个高信号强度峰作为两者的共有质量峰；

(2)为筛选VIM型和SPM型菌株之间有差异的特征峰，再次利用LaunchPad软件分别比较VIM型菌株和非VIM型以及SPM型菌株和非SPM型的质谱特征峰；

(3)最后选取VIM型菌株的4个特征峰和非VIM型的3个特征峰作为鉴定VIM型的模型，选取SPM型菌株的2个特征峰和非SPM型的2个特征峰作为鉴定SPM型的模型。

优选的，步骤(1)中，所述VIM型和SPM型菌株的筛选方法如下：先对258株亚胺培南耐药铜绿假单胞菌进行表型初筛实验，得到106株MBL表型阳性菌株，152株不产金属酶铜绿假单胞菌；再以106株MBL表型阳性菌株DNA为模板分别进行IMP、VIM、SPM、GIM、SIM和NDM基因的PCR扩增；最后将MBL基因阳性的PCR产物连接到TA载体上，连接载体经测序确认，得到VIM型阳性40株，SPM型阳性35株，未扩增出IMP、SIM、GIM和NDM阳性菌株。

优选的，步骤(1)中，聚类分析是依据VITEK MS RUO的质谱鉴定和科研仪标准操作流程(SOP)所述的方法，将VIM型和SPM型菌株质谱结果导入SARAMIS数据库，再通过SARAMIS软件对两种菌株质量相同的峰数量进行聚类分析，整个检测和分析时间只需花费几分钟，处理方式也比较简单快捷。

优选的，步骤(1)中，随机选择15株VIM型和15株SPM型菌株根据质量相同的峰数量进行聚类分析。