[发明专利]一种快速建立H9c2心肌细胞脂肪化模型的方法

权利要求书

1.一种快速建立H9c2心肌细胞脂肪化模型的方法，其特征在于，其方法步骤如下：

(1)细胞获取：将复苏冻存的H9c2细胞作为P0代心肌细胞，采用DMEM高糖完全培养基，于37℃、5％CO₂环境中连续培养至3代后，得到P3代心肌细胞；

(2)细胞消化：将上述P3代心肌细胞采用0.5～1ml的胰酶消化1～2分钟，之后加入5～8ml的DMEM高糖完全培养基终止消化，然后收集细胞悬液至15ml的离心管，将所述离心管置于离心机中，于1000～1200rpm下离心5～8分钟，弃去上层清液后，加入1～2ml的DMEM高糖完全培养基，重新得到细胞悬液；

(3)细胞计数：将步骤(2)最终得到的细胞悬液进行充分吹打混匀，取10μl细胞悬液与10μl台盼蓝染色液进行混合，加入细胞计数板进行细胞计数；

(4)细胞种板：将步骤(2)最终得到的细胞悬液按照细胞计数结果分别接种于六孔板内，每孔细胞数为1*10⁵～5*10⁵个/ml，然后加入2ml的DMEM高糖完全培养基，混匀，于37℃、5％CO₂环境中培养24小时后，弃去上层培养液，得到种板；

(5)诱导细胞脂肪化：配制脂性培养基，并将其加入到步骤(4)中得到的种板中，培养24～48小时后，得到脂肪化的H9c2心肌细胞。

2.根据权利要求1所述的一种快速建立H9c2心肌细胞脂肪化模型的方法，其特征在于，所述步骤(1)中每100mlDMEM高糖完全培养基中含有10ml的胎牛血清、4mmol的L-谷氨酰胺、10000U的青霉素以及10mg的链霉素。

3.根据权利要求1所述的一种快速建立H9c2心肌细胞脂肪化模型的方法，其特征在于，所述步骤(5)中的脂性培养基为OA脂性培养基和PA脂性培养基的混合，所述脂性培养基的具体配制方法如下：

1)配制OA储存液：

①配制20mmol/L的OA溶液：将0.04g的NaOH溶解于10ml的去离子水中，配制成0.1mol/L的NaOH溶液10ml，将19.04ul的OA加入3ml的NaOH溶液中，置于75℃水浴进行充分皂化约30分钟，直至无色透明澄清，得到3ml浓度为20mmol/l的油酸钠皂化液，即为OA溶液，对OA溶液进行保温；

②配制BSA溶液：将3ml的PBS溶液预热至55℃，将0.6g的BSA置于50ml的离心管中，将上述预热好的3ml的PBS溶液也加入离心管中，将离心管置于高速离心机中，于4500rpm下离心20分钟后得到3ml的BSA溶液；

③将步骤①保温的3ml的OA溶液迅速地加入步骤②的BSA溶液中，得到6ml浓度为20mmol/l的OA+BSA溶液，适当摇匀后，通过超净台细菌滤器进行过滤，得到OA储存液，并将其置于4℃环境下保存；

2)配制OA脂性培养基：将上述OA储存液加入DMEM高糖完全培养基中，稀释至浓度为400～650μmol/L；

3)配制PA储存液：

①配制40mmol/L的PA溶液：将0.04g的NaOH溶解于10ml的去离子水中，配制成0.1mol/L的NaOH溶液10ml，将0.0307g的PA加入3ml的NaOH溶液中，置于75℃水浴进行充分皂化约30分钟，直至无色透明澄清，得到3ml浓度为40mmol/l的棕榈酸钠皂化液，即为PA溶液，对PA溶液进行保温；

②配制BSA溶液：将3ml的PBS溶液预热至55℃，将1.2g的BSA置于50ml的离心管中，将上述预热好的3ml的PBS溶液也加入离心管中，将离心管置于高速离心机中，于4500rpm下离心20分钟后得到3ml的BSA溶液；

③将步骤①保温的3ml的PA溶液迅速地加入步骤②的BSA溶液中，得到6ml浓度为40mmol/l的PA+BSA溶液，适当摇匀后，通过超净台细菌滤器进行过滤，得到PA储存液，并将其置于4℃环境下保存；

4)配制PA脂性培养基：将上述PA储存液加入DMEM高糖完全培养基中，稀释至浓度为100～550μmol/L。

4.根据权利要求3所述的一种快速建立H9c2心肌细胞脂肪化模型的方法，其特征在于，所述OA脂性培养基中的OA浓度为600μmol/L，所述PA脂性培养基中的PA浓度为400μmol/L。