[发明专利]溶藻弧菌高效裂解性噬菌体vB_ValM-Yong3及其应用

权利要求书

1.溶藻弧菌的一种烈性噬菌体vB_ValM-Yong3，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18192。

2.根据权利要求1所述的溶藻弧菌的一种烈性噬菌体vB_ValM-Yong3，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以高致病性溶藻弧菌WY为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_ValM-Yong3；vB_ValM-Yong3可感染并裂解高致病性溶藻弧菌WY，使菌液澄清化，在溶藻弧菌WY的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。

3.根据权利要求1所述的溶藻弧菌的一种烈性噬菌体vB_ValM-Yong3，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径55nm(±5nm)，以及可收缩的尾部，长度为124nm(±15nm)；vB_ValM-Yong3基因组为双链DNA(dsDNA)，其序列不存在于已有数据库中，是一株未被报导的新的噬菌体。

4.根据权利要求1所述的溶藻弧菌的一种烈性噬菌体vB_ValM-Yong3，该噬菌体具有如下生物学特征：分离自浙江省宁波市梅山湾港口海水，位置为North latitude：29.764302，East longitude：121.922806；具体制备方法如下：

(1)溶藻弧菌的活化、培养

取溶藻弧菌WY株菌种划线接种于含质量体积比为1.5％的琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜后，从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL的LB海水液体培养基的试管内，摇床上于29℃、180rpm培养12小时；从试管中取1mL培养液，以1∶100的体积比稀释至装有100mL LB海水液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床上29℃、180rpm扩大培养至菌液OD₆₀₀≈0.6，即得到对数期菌液；

其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min；

(2)噬菌体的富集

采集梅山湾港口表层海水，置冰盒内，并立即带回实验室离心4℃、10000g、10min后，取40mL上清液于锥形瓶中，在瓶中加入20mL的3×LB海水液体培养基和1mL对数期溶藻弧菌WY菌液(OD₆₀₀≈0.6)，混匀后放置于摇床上29℃、180rpm培养3小时进行噬菌体富集。将培养液离心4℃、10000g、10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤；取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL 3×LB海水液体培养基和100μL对数期溶藻弧菌WY菌液混匀，作为实验组，另取一支试管加入6mL LB海水液体培养基、100μL对数期溶藻弧菌WY菌液混匀，作为对照组；将实验组、对照组试管放置于摇床上29℃、180rpm培养至实验组与对照组液体呈现肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片，然后将实验组培养液离心4℃、10000g、10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液4℃避光保存，作为后续操作的噬菌体原液；

其中，3×LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.0，121℃高压灭菌20min；

(3)噬菌体的纯化

将步骤(2)获得的噬菌体原液用LB海水液体培养基做10倍梯度稀释，取各个稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期溶藻弧菌WY菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中，孵育10min使噬菌体吸附；从43℃水浴中取出一份3mL/管分装的含质量体积比为0.7％琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于29℃预热半小时的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平，待凝固后将双层平板倒置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置琼脂与200ul溶藻弧菌WY对数期菌液、5mL含LB海水的液体培养基混合，摇床上29℃、180rpm培养3-5小时至宿主菌裂解澄清；将培养液离心4℃、10000g、10min后，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；取新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_ValM-Yong3原液；

(4)噬菌体的扩大培养

将步骤(3)纯化得到的噬菌体vB_ValM-Yong3-菌培养裂解液离心4℃、10000g、10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，将过滤液与溶藻弧菌WY对数期菌液按体积比1：4混合并加到含有50ml的LB海水培养基中作为实验组，取2mL溶藻弧菌WY对数期菌液加到含有50ml的LB海水培养基中作为对照组，一起放置于摇床上29℃、180rpm培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养，将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存；

(5)噬菌体悬液制备

取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心4℃、10000g、10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_ValM-Yong3悬液。