[发明专利]用于同步检测十种动物源成分的引物对、探针及方法

说明书

本发明提供一组用于同步检测十种动物源成分的引物对、探针及液相基因芯片方法，可同时检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源性成分，共设计筛选了10对动物源性成分特异性引物和10条特异探针，优化的不对称十重PCR反应体系、PCR扩增条件及悬浮微球杂交检测条件，可以实现同时对食品和饲料中驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊共十种动物源性成分进行检测鉴定，该方法具有操作简便、通量高、灵敏度高、特异性好和成本低等优点。

技术领域

本发明属肉制品和动物源性饲料检测领域，具体而言，一种同步检测驴、鸡、牛、鹿、犬、狐狸、马、水貂、猪和羊十种动物源成分的液相芯片方法。

背景技术

动物源成分真伪检测鉴别是食品与饲料质量安全重要内容，对维护人民健康安全、维护经济秩序和社会稳定、进出口食品与饲料监管均具有重要意义。近年来，国内外肉类产品掺杂使假违规犯罪行为屡被曝光，如国内某些不法商人采用低价值物种肉类如鸭肉、猪肉甚至狐狸肉、水貂肉等掺入甚至冒充高价值的牛、羊肉制品，并过量添加色素、香精等杂质。2013年1月，“马肉风波”事件影响欧洲16国，迫使欧盟重新审查其食品追溯体系和标签制度，并紧急出台措施要求成员国对市场流通的牛肉制品加强DNA抽检。动物源成分检测鉴别也是饲料安全重要内容，涉及传染性海绵状脑病(TSE)、非洲猪瘟、高致病性禽流感等重大疫病防控。自1987年欧洲发生疯牛病以来，为防控疯牛病，世界各国家均先后制定法律、法规，严格控制饲料中动物源性成分的使用；我国对来自“非疯牛病风险可忽略”国家和地区的饲用动物产品规定禁止含反刍动物源(牛、羊、鹿等)成分。为防控高致病性禽流感、非洲猪瘟、口蹄疫等其他重大动物疫病，各国也制定了针对饲料中特定动物源成分的禁令。

动物源成分的检测鉴定技术主要基于DNA和蛋白质分析两大类别，还有少数研究采用基于脂肪酸分子组成和结构差异的分析技术。由于蛋白质在食品和饲料加工过程中可能受到破坏，因此基于蛋白质分析技术的应用较为少见。目前国内外主要采用DNA分析技术检测鉴定动物源成分。DNA分子携带动物种属特异遗传信息，非常适合作为物种鉴别的检测靶点；DNA热稳定性好，在食品和饲料生产过程的热加工、高压处理中仍能保留小片段的核酸分子用于分析。基于PCR技术的不断发展，目前仅需痕量的DNA片段就能实现靶标的检测。

迄今，国内外开展的应用于动物源成分DNA分析技术的研究应用可归纳为以下几种类型：

1)基于PCR扩增的检测技术。包括PCR、PCR-RFLP、PCR-RAPD、PCR-AFLP、PCR-SSCP和实时荧光PCR技术等。常规的PCR技术由于需对扩增产物进行电泳或测序分析，检测时间延长、操作繁琐并易引发核酸污染并造成假阳性反应，虽然在早期建立了不少基于PCR的方法，但目前应用相对较小。近年来发展的实时荧光PCR技术技术显著提高了检测速度、检测灵敏度和特异性，但其检测成本(包括设备和试剂)较高，尤其是多重PCR方法。多重实时荧光PCR由于现有的设备平台和可供选用的荧光染料不能很好解决荧光信号交叉干扰以及仪器对不同荧光基团分辨敏感性差异问题，对于混合阳性模板、其检测敏感性往往比单色法有明显下降、不同检测通道间常出现信号交叉。

2)传统固相基因芯片技术。基于PCR联合DNA杂交的基因芯片技术已见应用于检测鉴别多种动物种成分，欧洲研发了肉类基因芯片分析试剂盒，可筛查8-14种动物物种。上述研究均为传统固相基因芯片技术，采用常规尺寸的片状载体(硅片、光学载玻璃片、纤维素膜、尼龙膜等)作为固相基质载体，能够提供高通量检测，但其缺点是需要点样仪、杂交仪、扫描仪等多种专用设备，成本高，并且操作繁琐、造成干扰因素较多，检测稳定性、重复性效果不理想，影响临床应用。

3)环介导等温扩增技术。国内外已见应用LAMP技术检测鉴别动物源成分，但研究报道并不多。LAMP技术是一种等温扩增方法，无需变温控制设备如PCR扩增仪，适合基层应用。但该方法有明显的局限性，不适合进行长链DNA扩增，不适合建立多重检测方法，扩增产物不能直接用于后续分析，且易产生假阳性反应。