[发明专利]哈维氏弧菌高效裂解性噬菌体vB_VhaS-yong 2及其应用

权利要求书

1.哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-yong 2，该噬菌体于2019年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18194。

2.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-yong 2，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以高致病性哈维氏弧菌LDF为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_VhaS-yong 2；vB_VhaS-yong 2可感染并裂解高致病性哈维氏弧菌LDF，使菌液澄清化，在哈维氏弧菌LDF的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。

3.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-yong 2，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径约为69nm，尾部长度约为195nm；vB_VhaS-yong 2基因组为双链DNA(dsDNA)，全长为86660bp，其序列不存在于已有数据库中，是一株未被报导的新的噬菌体。

4.根据权利要求1所述的哈维氏弧菌的一种烈性噬菌体vB_VhaS-yong 2，该噬菌体具有如下生物学特征：分离自福建省厦门市集美区红树林泥土，泥土采集位置为Northlatitude：24.5818813，East longitude：118.1120358；具体制备方法如下：

(1)哈维氏弧菌LDF的活化、培养

取LDF菌种划线接种于含2％琼脂的LB海水固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜，从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB海水培养基的试管内，摇床上29℃、180rpm培养12小时；从试管中取1mL培养液稀释至装有100mL LB海水培养基的锥形瓶中，放置于摇床上29℃、180rpm，扩大培养约3h至菌液OD₆₀₀≈0.6，即得到对数期菌液；

其中LB海水培养基的配方如下：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min；

(2)噬菌体的富集

从福建省厦门市集美区红树林采集泥土，置冰盒内，带回实验室后，向采集的泥土中加入两倍体积LB海水培养基，涡旋震荡混匀后，离心4℃ 10000g 10min，取60mL上清液于锥形瓶中，向瓶中加入1mL对数期LDF菌液，混匀后放置于摇床上29℃、220rpm培养3小时进行噬菌体富集；将培养液离心4℃ 10000g 10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤；取一支试管，加入4mL上述过滤液、2mL 3×LB海水培养基、100μL对数期LDF菌液混匀，作为实验组；另取一支试管加入6mL LB海水培养基、100μL对数期LDF菌液混匀，作为对照组；将实验组、对照组试管放置于摇床上29℃ 220rpm培养，至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片后，将实验组培养液继续下一步实验或者4℃避光保存；

其中，3×LB海水液体培养基的配方如下：胰蛋白胨30g，酵母提取物15g，用经棉花过滤的海水定容至1L，调pH至7.2，121℃高压灭菌20min；

(3)噬菌体的分离、纯化

将步骤(2)获得的噬菌体培养液离心4℃ 10000g 10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤后，用LB海水培养基做10倍梯度稀释，取各稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LDF菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附；从45℃水浴中取出一份4mL分装的含0.7％琼脂的LB海水培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于37℃预热30min以上的LB海水固体培养基平板上，均匀铺平；待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取噬菌斑中心位置琼脂置于5mL对数期LDF菌液中，摇床上29℃ 220rpm培养至宿主菌裂解澄清；将培养液离心4℃ 10000g 10min后，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；取新噬菌体原液继续使用上述双层平板法，重复进行三代噬菌体纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_VhaS-yong 2原液；

(4)噬菌体的扩大培养

将步骤(3)经噬菌斑试验纯化得到的第三代噬菌体vB_VhaS-yong 2原液离心4℃10000g 10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤；将过滤液与对数期LDF菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LDF菌液作为对照组，一起放置于摇床(29℃，220rpm)上培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时，停止培养；将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存；

(5)噬菌体悬液制备

取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液离心4℃ 10000g 10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径针头过滤器过滤，即为噬菌体vB_VhaS-yong 2悬液。