[发明专利]温和气单胞菌高效裂解性噬菌体vB_AsoP-yong及其应用

权利要求书

1.温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，该噬菌体于2019年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17097。

2.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以致病性温和气单胞菌LY-23为靶标分离获得的噬菌体，命名为vB_AsoP-yong；vB_AsoP-yong可感染并裂解温和气单胞菌，使菌液澄清化，在温和气单胞菌的菌平板上可以形成透明的噬菌斑。

3.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径约为55nm，以及不可收缩的尾部，长度约为20nm；最适MOI为0.001，潜伏期约为50min，裂解期为50min-150min；爆发量极高，达到7665PFU/Cell；对温度、pH、氯仿等因素有着较好的耐受能力，在40℃、pH 4-10或2.5％的氯仿胁迫下活性均稳定。

4.根据权利要求1所述的温和气单胞菌的一种烈性噬菌体vB_AsoP-yong，其特征包括：分离自浙江省宁波市慈城镇官山河水，水样采集的位置为North latitude：29.9699719，East longitude：121.4543285；具体制备方法如下：

(1)温和气单胞菌LY-23的活化、培养

取LY-23菌种划线接种于含1.5％琼脂的LB固体培养基平板上，29℃倒置培养过夜。从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL LB液体培养基的试管内，在摇床内于29℃、180rpm培养12小时后，从试管中取1mL培养液稀释至装有100mL LB液体培养基的锥形瓶中，放置于摇床内于29℃、180rpm培养至菌液OD₆₀₀≈0.6，即得到对数期菌液；

(2)噬菌体的富集

噬菌体vB_AsoP-yong分离自浙江省宁波市慈城镇官山河水，从河中采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室处理，将采集的水样于4℃、10000g离心10min后，取40mL上清液于锥形瓶中，在瓶中加入20mL 3×LB液体培养基与1mL对数期即OD600≈0.6的LY-23菌液，混匀后放置于摇床于29℃、180rpm培养3小时以进行噬菌体富集；将富集培养液于4℃、10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤；取一支试管，依次加入4mL过滤液、2mL 3×LB液体培养基、100μL对数期LY-23菌液混匀，作为实验组；另取一支试管加入6mL LB液体培养基、100μL对数期LY-23菌液混匀，作为对照组；将实验组、对照组试管放置于摇床于29℃、180rpm培养至实验组与对照组液体有肉眼可见差异，即实验组培养液变澄清、出现细菌碎片后，将实验组培养液于4℃、10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤；过滤液4℃避光保存，作为后续操作的噬菌体原液；

(3)噬菌体的分离纯化

将步骤(2)获得的噬菌体原液用LB液体培养基做10倍梯度稀释，取各个稀释度的稀释液100μL分别与200μL对数期LY-23菌液混合，放置于29℃恒温培养箱中孵育10min使噬菌体吸附；从45℃水浴中取出一份5mL分装的含0.7％琼脂的LB培养基，立刻与孵育后的噬菌体-菌混合液混合，漩涡震荡3秒混匀后，倒于已于29℃预热半小时的LB固体培养基平板上，均匀铺平；待凝固后将双层平板置于29℃培养箱中过夜培养，至平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置的琼脂置于5mL对数期LY-23菌液中，摇床内于29℃、180rpm培养至宿主菌裂解澄清；将培养液于4℃、10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌斑纯化实验，即得到纯化的噬菌体vB_AsoP-yong原液；

(4)噬菌体的扩大培养

将步骤(3)纯化得到的噬菌体-菌培养裂解液于4℃，10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，将过滤液与对数期LY-23菌液按体积200μL：20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期LY-23菌液作为对照组，一起放置于摇床于29℃、180rpm培养，至实验组与对照组液体出现肉眼可见差异时停止培养，将噬菌体-菌培养裂解液置于4℃保存；

(5)噬菌体悬液制备

取步骤(4)制备的噬菌体-菌培养裂解液于4℃、10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_AsoP-yong悬液。