[发明专利]地中海弧菌烈性噬菌体vB_VmeM-Yong及其应用

权利要求书

1.地中海弧菌的一种烈性噬菌体vB_VmeM-Yong，该噬菌体于2019年1月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.17098。

2.根据权利要求1所述的地中海弧菌的一种烈性噬菌体vB_VmeM-Yong，该噬菌体具有如下生物学特征：是首株以致病性地中海弧菌117-T6为靶标分离获得的噬菌体，亦是首株分离、鉴定的地中海弧菌噬菌体，命名为vB_VmeM-Yong；vB_VmeM-Yong可感染并裂解致病性地中海弧菌117-T6，使菌液澄清化，在地中海弧菌117-T6平板上可以形成透明的噬菌斑。

3.根据权利要求1所述的地中海弧菌的一种烈性噬菌体vB_VmeM-Yong，该噬菌体具有如下生物学特征：呈现二十面体近似球形的头部，直径109nm(±9nm)，具有可收缩的尾部，长度320nm(±50nm)；潜伏期约为40min，裂解期约为40min-150min。

4.根据权利要求1所述的地中海弧菌的一种烈性噬菌体vB_VmeM-Yong，其特征包括：分离自浙江省宁波市北仑区梅山岛表层海水，水样采集的具体位置为North latitude：29.7831421；East longitude：121.9586032；具体制备方法如下：

(1)地中海弧菌117-T6的活化、培养

取117-T6菌种划线接种于含1.5％琼脂的海水营养固体培养基平板上，26℃倒置培养过夜；从平板上挑取单菌落，接种到装有5mL海水营养培养基的试管内，摇床上26℃、180rpm培养12小时；从试管中取1mL液体培养液稀释至装有100mL海水营养培养基的锥形瓶中，放置于摇床上26℃、180rpm扩大培养至菌液OD₆₀₀≈0.6，即得到对数期菌液；

其中海水营养培养基配方：蛋白胨10g，牛肉膏3g，加入过滤海水定容至1L，pH7.2，高压灭菌；

(2)噬菌体的富集

从浙江省宁波市北仑区梅山岛海边采集表层水样，置冰盒内，并立即带回实验室，充分颠倒混匀后，10000g离心10min，取上清80mL到250mL锥形瓶中，在锥形瓶中加入40ml 3×海水营养培养基和2mL新鲜培养的对数期117-T6菌液，混匀后放置于摇床上26℃、180rpm培养3-4小时进行噬菌体富集；将富集培养液离心4℃、10000g、10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，滤液即为的噬菌体富集液；

点板验证：取融化状态下于42-45℃保温超过半小时的含0.7％琼脂的海水营养培养基与500μL对数期117-T6菌液迅速混匀，立即倾倒于含1.5％琼脂的海水营养培养基单层平板上，铺平，冷却凝固后，点2μL噬菌体原液于平板上，28℃过夜培养，翌日双层平板上点噬菌体富集液出出现明显透明噬菌斑；

噬菌体的进一步富集：取两根试管，其中一根用作实验组，添加如下组分：6mL上述噬菌体富集液、2mL 3×海水营养培养基、100μL新鲜的对数期117-T6菌液，对照组添加如下组分：8ml 1×海水营养培养基+100μL新鲜的对数期117-T6菌液；将试管置于26℃、180rpm摇床培养过夜；翌日，实验组培养液较对照组明显澄清，将培养液4℃、10000g离心10min，取上清液依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，滤液即为的二次噬菌体富集液；

其中3×海水营养培养基配方：蛋白胨30g，牛肉膏9g，加入过滤海水定容至1L，pH7.2，121℃高压灭菌20min；

(3)噬菌体的分离纯化

将步骤(2)获得的二次噬菌体富集液用海水营养培养基做10倍系列梯度稀释，分别取10^-4、10^-5、10^-6、10^-7稀释度的稀释液各100μL与200μL新鲜的对数期117-T6菌液混合，在室温下，摇床上孵育10min，将该混合物加入至5ml的预先融化并在42-45℃保温超过半小时的含0.7％琼脂的半固体海水营养培养基中，立即充分混匀并倾倒于29℃预热的含1.5％琼脂的海水营养培养基单层平板上，均匀铺平，待上层胶冷却凝固后放于28℃培养箱内过夜培养，平板上有噬菌斑形成；选取噬菌斑密度合适的平板，挑取单个噬菌斑中心位置至5mL新鲜的对数期117-T6菌液中，摇床上28℃、180rpm过夜培养至宿主菌裂解澄清；将培养液离心10000g离心10min后，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，过滤液即为新一代噬菌体原液；新噬菌体原液继续使用上述双层平板法重复进行三代噬菌体挖斑纯化实验，即得到纯化培养的噬菌体vB_VmeM-Yong原液；

(4)噬菌体的扩大培养

将步骤(3)纯化培养得到的vB_VmeM-Yong原液与新鲜的对数期117-T6菌液按体积200μL∶20mL的比例混合作为实验组，设置20mL对数期117-T6菌液作为对照组，一起放置于摇床于26℃，180rpm培养，至实验组与对照组液体比出现肉眼可见明显差异时停止培养，将噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液置于4℃保存；

(5)噬菌体悬液制备

取步骤(4)制备的噬菌体vB_VmeM-Yong-菌培养裂解液在4℃、10000g离心10min，取上清液，依次经过0.45μm、0.22μm孔径硝酸纤维素滤膜过滤，即为噬菌体vB_VmeM-Yong悬液。