[发明专利]一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备方法，具体包括如下步骤：

(1)制备AuNPs-DNA复合物

1)将两种不同的巯基化寡核苷酸经TCEP活化1-3h，得活化后的DNA溶液；

2)在步骤1)得到的活化后的DNA溶液中加入0.5-2mL的AuNPs，静置10-14h后，再加入NaCl，并在37℃下摇动，使氯化钠浓度达到0.3-0.8M，然后离心10-30min，冲洗去除未结合的DNA，制得AuNP S -DNA复合物，储存在4℃备用；

(2)构建电化学免疫传感器

1)制备金电极

a)金电极用氧化铝粉末抛光，得到抛光后的电极；

b)将步骤2-1)-a)中抛光后的电极浸泡在水虎鱼溶液中2-20min消除吸附的有机物，并用去离子水彻底清洗；

c)再将电极用50％硝酸浸泡10-30min，然后分别用乙醇和去离子水处理电极2-8min，再用氮气吹干后，将电极浸入0.5M硫酸中，用循环伏安法从0到1.6V进行扫描直到获得稳定的信号；

2)将步骤1)制得的金电极浸入含有0.6-2μM的DBCO-DNA缓冲液中孵育8-16h，然后用含有0.5-2mM MCH的水溶液处理20分钟；

其中，DBCO-DNA的序列如SEQ ID.1所示；

3)用去离子水进一步多次冲洗步骤2)制得的电极并用氮气吹干燥，再将电极轻轻浸入含有0.1-1μm的CFP-10适配体、互补-DNA混合的溶液中孵育0.5-2h，用去离子水清洗干净，最后将电极浸入含有不同浓度的结核分枝杆菌CFP-10抗原和N3-DNA溶液中,其中N3-DNA的浓度为0.25μM，在37℃孵育40min，制得电极备用；

其中，CFP-10适配体的序列如SEQ ID.2所示；

其中，互补-DNA的序列如SEQ ID.3所示；

其中，N3-DNA的序列如SEQ ID.6所示；

4)将8-12μL步骤1制得的AuNPs -DNA复合物滴加在步骤2-3)制得的电极表面，保持37℃，0.5-2h，用PBS和去离子水依次清洗后，用氮气吹干；

5)将hemin溶液滴加在上述电极表面，37℃，1-3h，形成DNA模拟酶，实现DNA模拟酶的富集；

(3)电化学免疫传感器的检测

1)工作电极为金电极，在660E电化学分析仪上进行电化学测量，差分脉冲伏安法在PBS中进行，而电化学阻抗谱实验在铁氰化钾复合溶液和硝酸钾中进行，实验参数如下：对于DPV实验，扫描范围为-0.1V至0.2V。

2.如权利要求1所述的结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器的制备方法，其特征在于，5′至3′端序列如下：

SEQ ID NO.1：Dibenzocyclooctyne(DBCO)-DNA,

SH-CGTACAACCAAC-DBCO；

SEQ ID NO.2：CFP-10aptamer(CFP-10Apt)：TCCTGAAAGGGGCCTGCCCCACTATCTCACATGGGGTTCAGTTGGTTGTACG；

SEQ ID NO.3：互补-DNA Complementary probe(CP)：TGAACCCCATGTGAGATAGTGGGGCAGGCCCCTTTCAGGA；

SEQ ID NO.4：DNA 1,TGGGTAGGGCGGGTTGGGTTTTTT-SH；

SEQ ID NO.5：DNA 2,GGGGCAGGCCCCTTTCAGGATTTTTT-SH；

SEQ ID NO.6：azide(N 3 )-DNA,N 3 -TGAACCCCATGTGAGATAGT。