[发明专利]一种结核分枝杆菌CFP-10抗原免疫传感器及其制备方法和应用有效
申请号: | 201910794022.2 | 申请日: | 2019-08-27 |
公开(公告)号: | CN110687178B | 公开(公告)日: | 2022-06-07 |
发明(设计)人: | 李金龙;张永臣;张侠;许传军;胡凯 | 申请(专利权)人: | 南京市第二医院;南京鼓楼医院 |
主分类号: | G01N27/327 | 分类号: | G01N27/327 |
代理公司: | 南京瑞弘专利商标事务所(普通合伙) 32249 | 代理人: | 冯慧 |
地址: | 210003 *** | 国省代码: | 江苏;32 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 结核 分枝杆菌 cfp 10 抗原 免疫 传感器 及其 制备 方法 应用 | ||
本发明通过靶标循环策略和DNA模拟酶信号放大策略构建了一种可以检测结CFP10抗原的免疫传感器,使用该检测器的检测方法具有以下优势:由于适配体与CFP10较强的结合性能,因此本发明具有极强的特异性;由于靶蛋白的循环利用和DNA模拟酶的辣根过氧化物酶活性,实现了较低CFP‑10抗原检测限(0.01ng.ml‑1);该方法没有使用到抗体及辣根过氧化物酶等,降低了检测成本。本发明免疫传感器利用该抗原的DNA适配体代替抗体,来实现该抗原的检测,该电化学免疫传感器利用DNA模拟酶作为信号放大元件,由于DNA空间结构较小,可以富集在金纳米颗粒表面,具有产生放大信号的作用,本发明所提出的CFP‑10抗原检测方法在生物医学研究和临床诊断中有着广阔的应用前景。
背景技术
结核分枝杆菌(MTB)感染在经济发展落后的国家及地区形势依然严峻,传染率极高,且容易引起隐蔽性感染,所以发病率和死亡率居高不下。对于结核病的防控,除了需要及时的治疗措施外,早期诊断,早期发现显得尤为重要。因此,建立一种可以灵敏、快速检测结核分枝杆菌的方法和传感器一直是研究的热点,对人类健康具有重要意义。研究者们已经发展了多种诊断方法,如结核分枝杆菌培养、结核菌素皮肤试验和痰涂片显微镜检查法,但都有其非常明显的确定啊。例如,MTB诊断的金标准方法-结核分枝杆菌培养,一般需要一个月甚至数月,对于结核病人的治疗极为不利;结核菌素皮肤试验,其特异性较低,虽然是目前最广泛使用的方法,但不利于结核病的诊断;而痰涂片显微镜检查方法既取决于痰标本的质量,又取决于痰标本的细菌负荷,且灵敏度低。在过去的几年里,虽然人们致力于改进结核病检测方法,灵敏、快速的结核病检测方法仍然是必要的。
为了克服传统方法的缺点,近年来,人们发展了多种检测新技术对结核分枝杆菌抗原进行检测以达到对结核分枝杆菌感染的诊断,如基于表面等离子体共振(SPR)的方法检测结核分枝杆菌抗原和通过免疫传感器检测CFP10等结核分枝杆菌抗原。其中,基于电化学免疫传感器方法逐渐引起了科研者的兴趣,电化学免疫传感器是利用电极表面的物质的氧化还原反应,产生电子传递,根据电子传递的多少来对电极表面的反应物质进行定量,传统的免疫传感器利用电极表面修饰的酶标记抗体来对抗原进行定量,随着纳米科技的发展,研究者逐渐将纳米材料应用到电化学免疫传感器,可以实现酶的聚集,及各种信号放大策略的实施,因此该方法更具有灵敏度高、操作简单等内在的独特优势。
中国专利CN201110056230.6公开了用于结核病血清学诊断的特异电化学免疫传感器,该免疫传感器是将免疫测定法与高灵敏的传感技术相结合而构建的一类新型生物传感器,应用于痕量免疫原性物质的分析研究,基于前期的抗原标记筛选工作,选定结核分枝杆菌Rv2175c基因编码蛋白(下称特异性抗原)作为特异性抗原,构建高灵敏度电化学免疫传感器,通过检测人体血清中对应该特异抗原的抗体而实现结核病血清学诊断。通过该免疫传感器电流变化差异,该免疫传感器能很好的将健康人和结核病患者区分开,达到血清学诊断目的,但该发明的检应用范围还不够广泛,灵敏度也待提高。
免疫学方法对结核分枝杆菌进行检测,主要通过对抗原的检测实现,结核分枝杆菌抗原种类繁多,但是标志性的抗原主要包括:结核杆菌抗原85A(Ag85A),结核杆菌抗原85B(Ag85B)、及Ag85A、Ag85B和Ag85C组成的复合体抗原、人培养滤液蛋白10(CFP10)和结核分枝杆菌分泌性蛋白(ESAT6)等,这些抗原的都有一个共同的特点:浓度低,需要灵敏度高的方法进行检测。由于结核分枝杆菌抗原水平很低,现有的传统免疫方法(如ELISA方法)存在检测限的问题,很难检测到如此低浓度的抗原,对于结核病的早期诊断是一个巨大挑战,综上,临床上迫切需要一种高灵敏度的方法来对结核分枝杆菌抗原检测,以达到为结核病的早期诊断提供依据。
因此,本发明构建了一种双信号放大的结核分枝杆菌抗原CFP10检测的电化学免疫传感器,结核病的早期、快速诊断奠定了基础。
发明内容
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