[发明专利]一种间充干细胞的制备方法

权利要求书

1.一种间充干细胞的制备方法，其特征在于：具体制作方法包括以下，

S1,首先对提取的生物组织进行充分的清洗，以备用；

S2,将生物组织送入离心旋转机中进行高速旋转分离，并加入生物酶进行溶解；

S3,对细胞进行诱导分化；

S4,采用基因克隆方法进行复制干细胞；

S5,制作培养基，将分化后的干细胞进行培养，并冷藏保存。

2.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，所述生物组织包括骨髓、脐带血和脐带组织、胎盘组织、脂肪组织及牙髓。

3.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2中，具体包括以下步骤，剪碎成0.5-1.5mm的组织块,加入IV型胶原酶(1.0g/L),置37C恒温振荡培养箱振荡消化3h后,用80目滤网过滤,将滤过的细胞悬液离心洗涤，然后用无血清培养液混匀细胞,以1.0x10⁵/cm²接种于T-75cm²培养瓶中,置37C、饱和湿度、5％CO²培养箱中培养,每隔3-4h换液，融合至80％-90％传代培养,加入2.5g/L胰酶消化,按1:2或1:3传代至T-75cm²培养瓶中。

4.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3中，先将冻存细胞取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促进其融化。移入15ml离心管中，加入10ml预热的DMEM完全培养基，轻轻吹匀，离心，2000rpmX2min，弃上清液。加入10mlDMEM培养基清洗，弃上清液；加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹打，接种于10cm盘中，在含5％CO2的细胞培养箱中培养；

细胞密度达到80％-90％时.去培养基，10mlPBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加人1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管，加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpmX2min，弃上清液，再加入10mlPBS，经高压灭菌，保存于40C，吹匀，吸取10微升进行计数，按照1×105/盘接种，继续培养。

细胞密度达到80％～90％时，使用10ml PBS清洗2次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入细胞培养箱3min；加入1ml DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移至15ml离心管,加入10ml PBS清洗细胞培养盘，转移至15ml离心管，2000rpm×2min，弃上清液。

5.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，所述克隆方法包括以下步骤，L1，进行目的基因的克隆，根据基因序列互补原则，设计合适的引物序列，以DNA为模板，利用PCR技术扩增不同的目的DNA片段；

L2、在载体中进行重组：通过限制内切酶将两个DNA片段进行酶切并回收，然后通过连接酶将两个具有相同末端酶切位点的基因片段进行体外连接，并克隆到高表达质粒载体中，构建重组质粒；

L3、将重组表达载体转染宿主细胞并利用选择标志进行筛选及测序，然后重复循环操作，直到克隆完成。

6.根据权利要求1所述的一种间充干细胞的制备方法，其特征在于，所述培养基包括以下重量百分数的组分：核糖核酸8％、脱氧核糖核酸1％、寡核苷酸1.5％、多聚核苷酸3.2％、五碳糖2.3％、融合蛋白1.5％、维生素4.3％、抗病毒多肽1.5％、细胞因子模拟肽3.7％、小分子活性多肽2.8％、乳酸1.8％、乙醇酸0.4％、氯化锌0.3％、氯化钠0.2％和余量碳水化合物。