[发明专利]一种新型的测定生物样品中醛酮化合物的衍生化方法

说明书

本发明公开了一种新型的衍生化试剂和采用该试剂测定生物样品中醛酮化合物的衍生化方法。衍生化试剂命名为CILAT（Cleavable Isobaric Labeled Affnity Tag），可以从代谢物环境中选择性标记醛酮化合物。这个衍生化试剂由三部分组成：1）一个能够与羰基进行特异性反应形成共价键的氨氧基官能团；2）一个能够被光裂解的生物素基团用于标记后的醛酮化合物的亲和富集；3）一个含有稳定同位素标记的同量异位标签（Isobaric Tag）用于醛酮化合物的定量分析。检测方法包括：衍生化试剂分别和不同待测样品中的醛酮化合物反应后，混合在一起，然后利用生物素和链霉亲和素蛋白之间的强作用力富集CILAT标记后的分子，最后用紫外光把生物素部分切断，产生的剩余分子可以用高分辨质谱LC‑MS/MS进行分析。

技术领域

本发明涉及化学小分子检测试剂技术领域，具体为一种新型的测定生物样品中醛酮化合物的衍生化方法。

背景技术

生物小分子代谢物的定量研究具有很大的潜力，可以发现酶的功能，揭示以前未知的途径，以及发现新的疾病标志物。在数百种含有广泛的结构和多种功能的代谢物中，含有羰基(carbonyl group)的醛类和酮类化合物(醛酮化合物)通常与生物个体的氧化应激有关。因为氧化应激在众多人类疾病中(例如：糖尿病，癫痫，自闭症，癌症)起着重要作用，定量测量醛酮类化合物能够促进疾病机理的研究以及全新的治疗方法的开发。

测定生物样品中的醛酮化合物通常是由气相或者液相色谱-质谱联用技术实现的(GC-或LC-MS)。因为这些分子在质谱中的电离能力差，它们通常需要衍生化来提高检测的灵敏度。例如，可以通过羰基与氨氧基(aminooxy group)的特异反应或者羰基和氨基之间的还原性胺化反应(reductive amination)引入叔胺或季胺。这样可以显著改善它们在质谱正模式下的电离，从而大大提高质谱检测的灵敏度。同时，衍生法也允许引入稳定同位素标记，从而可以对不同生物样品中的醛酮化合物进行定量比较。但是，由于醛酮化合物在生物样本中的浓度远远低于其他类的代谢产物(例如：氨基酸和硫醇)，因此，复杂生物混合物中的醛酮合物的信号很容易被抑制，从而增加了检测这类化合物的难度。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了一种新型的测定生物样品中醛酮化合物的衍生化方法。

为了解决在复杂生物样品中精确定量测定醛酮化合物的种类和含量，本发明公开了一种新型的衍生化试剂，命名为CILAT(Cleavable Isobaric Labeled Affinity Tag)，可以从代谢物环境中选择性标记醛酮化合物。这个衍生化试剂由三部分组成：1)一个能够与羰基进行特异性反应形成共价键的氨氧基官能团；2)一个能够被光裂解的生物素基团用于标记后的醛酮化合物的亲和富集；3)一个含有稳定同位素标记的同量异位标签(Isobaric Tag)用于醛酮化合物的定量分析。这个衍生化试剂同时具有多种优势。例如，衍生化的醛酮化合物中也含有叔胺，可以增强待测化合物在质谱中的离子化和灵敏度；生物素基团的存在允许衍生化的醛酮化合物的富集纯化，进一步通过消除其他干扰来提高灵敏度；同量异位标签允许多个生物样本中的醛酮化合物在一次实验中同时定量，大大提高了样品分析的通量。这个同量异位标签是CILAT试剂的一部分，其结构包括报告基团(reporter)和平衡基团(balancer)，其中报告基团和平衡基团是通过MS/MS可剪切键连接。整套CILAT衍生化试剂可以包括2～10个化学结构完全相同的分子，在每个分子中的同量异位结构的不同位置处含有13C或15N同位素。报告基团的质量是不同的，但是报告基团的不同质量被平衡基团所补偿。这样每个试剂中的报告基团+平衡基团的质量是相同的。采用这样的同量异位标签，多达10个生物样品中的醛酮化合物可以在一次分析中定量。同时，由于不同生物样本中的醛酮化合物被同量异位标签标记后显示同样的质量，因此在一级质谱中不会引入额外的复杂性，能大大简化数据分析。