[发明专利]一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用

权利要求书

1.一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如(1)所示：

(1)；

硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

(1) 将4-溴-1，8-萘二甲酸酐与N-（2-氨基乙基）-4-甲基苯磺酰胺在乙醇中加热回流8~12h，冷却抽滤干燥得到化合物1；

(2) 将化合物1与N-羟基琥珀酰胺，碳酸钾溶于二甲基亚砜中加热回流4~6 h，冷却倒入冰水中，用盐酸调pH到5~8析出固体抽滤烘干得到化合物2；

(3) 将化合物2与三乙胺，二甲氨基吡啶溶于干燥的二氯甲烷与乙腈的混合溶液，冰浴条件下加入三氯乙基硫酰氯，室温反应12~16小时，旋干溶剂进行柱层析分离，得到白色化合物3；

(4) 将化合物3与锌粉，甲酸铵溶于二氯甲烷与甲醇混合溶液，室温反应1~6 h，旋干溶剂进行柱层析分离，得到所述比率型双光子荧光探针，命名为探针ERNathS；

比率型双光子荧光探针在作为检测硫酸酯酶的试剂中的应用：采用上述探针ERNathS作为硫酸酯酶的特异性底物，探针本身为强蓝色荧光，通过与硫酸酯酶的酶促反应诱导其硫酸酯基团的离去后发出黄色荧光，通过定量检测单位时间内的反应产物的荧光强度与探针荧光强度的比值F₅₆₄/F₄₅₁来定量测定不同生物体系中硫酸酯酶的活性；

所述步骤(3)中，化合物2与三乙胺的摩尔比1:(1~3)；化合物2与二甲氨基吡啶的摩尔比1:(0.5~2)；化合物2与二氯甲烷的摩尔体积比为1:(2~5) mmol/mL；化合物2与乙腈的摩尔体积比为1:(1~3)mmol/mL；

所述步骤(4)中，化合物3与锌粉的摩尔比1:(2~6)；化合物3与甲酸铵的摩尔比1:(0.5~3)；化合物3与二氯甲烷的摩尔体积比为1:(1~5)mmol/mL；化合物3与甲醇的摩尔体积比为1:(2~6)mmol/mL。

2.根据权利要求1所述硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述步骤(1)中，4-溴-1，8-萘二甲酸酐、N-（2-氨基乙基）-4-甲基苯磺酰胺的摩尔比1:(1~3)；4-溴-1，8-萘二甲酸酐与乙醇的摩尔体积比为1:(5~7) mmol/mL。

3.根据权利要求1所述硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述步骤(2)中，化合物1与N-羟基琥珀酰胺的摩尔比1:(1~3)；化合物1与二甲基亚砜的摩尔体积比为1:(2~5) mmol/mL。

4.根据权利要求1所述比率型双光子荧光探针，其特征在于，所述检测硫酸酯酶的具体方法如下：

体系中以1，8-萘酰亚胺类硫酸化衍生物作为比率双光子探针底物，在Tri-HCl缓冲溶液中，反应温度为20℃至45℃之间，孵育pH环境介于3~10之间，反应时间为0~120min，确保以上底物相应的脱硫酸酯产物达到定量限，可采用紫外分光度计和荧光检测器同时实现底物及产物的快速、灵敏检测；荧光检测条件：激发波长为405nm，最大发射波长分别为451nm和564nm。

5.根据权利要求4所述比率型双光子荧光探针，其特征在于，反应温度为37℃；孵育pH环境为5。