[发明专利]一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用

说明书

本发明公开了一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用，所述荧光探针的结构式如下所示：本发明比率型双光子荧光探针以1,8‑萘酰亚胺为双光子荧光基团，以硫酸酯作为酶切位点，构建比率型双光子硫酸酯荧光探针。该探针通过与硫酸酯酶的酶促反应诱导其硫酸酯基团的断裂及离去，分别通过探针及其反应产物的两个不同波长处荧光强度的比值(F₅₆₄/F₄₅₁)的变化，来检测硫酸酯酶的存在及其活性大小。该特异性探针为一类比率型的双光子荧光探针，其在活性检测过程不易受生物体背景及杂质的干扰，可用于各种活细胞及亚细胞水平及动物组织中硫酸酯酶活性的定量检测。

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，涉及一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术

硫酸酯酶是一种属于硫酸酯酶家族的水解酶，主要参与芳香基硫酸酯的催化水解过程，可以调节人体和细菌内诸多生物分子的硫酸化水平。这一调节过程同细胞中激素调节、细胞组分降解、信号通路的调控、细菌感染及炎症等有着密切的关联。其中一类硫酸酯酶定位于内质网，由于其能够调节类固醇，这种酶又被称作类固醇硫酸酯酶(Steroidsulfatase，STS)。STS水解释放类固醇前体，影响激素相关的信号通路，因此与常见的激素依赖性肿瘤(乳腺癌，卵巢癌，子宫内膜癌和前列腺癌)的生长和迁移紧密相关。无活性的雌激素硫酸盐只能通过STS介导的脱硫反应转化为活性雌激素，才能与雌激素受体结合来引发一系列促进作用在癌症信号通路中。由于STS在激素性依赖肿瘤组织中具有高活性，因此近年来以STS作为癌症治疗的靶点受到了广泛地关注，关于STS小分子抑制剂治疗激素相关肿瘤的研究已应用于I期临床。但目前因缺乏原位检测的工具难于深入了解STS的生理和病理作用。因此，仍需要开发一种直接有效的方法用于活细胞和组织中STS的原位检测，这在肿瘤早期诊断和治疗等方面具有重要的意义。

近年来，由于具有高时空分辨、高灵敏度、高选择性和非侵入性等优势，荧光分析检测技术已广泛地应用于生物分子标记、酶分析、环境监测、细胞染色和临床检验诊断等各个领域。基于对商业化硫酸酯酶探针：4-甲基伞形酮硫酸盐的修饰，一些新的荧光探针被报道用于体外检测硫酸酯酶[J.S.Rush et al,ChemBioChem,2010,11,2096-2099；C.H.Taiet al,Chem.Commun.,2014,50,6116-6119；K.E.Beatty et al,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,2013,110,12911-12916]。但这些探针缺乏比率特征和亚细胞器靶向，因此难以用于活细胞或亚细胞器中硫酸酯酶(如内质网硫酸酯酶STS)的定量检测。

发明内容

针对现有探针缺乏比率特征和亚细胞器靶向，难以用于活细胞或亚细胞器中硫酸酯酶的定量检测的技术问题，本发明的目的是提供一种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针及其合成方法和应用，该比率型探针在具有良好双光子性质的荧光团上引入硫酸酯酶的位点，发射强蓝色荧光，再与硫酸酯酶反应脱硫酸盐后具有黄色荧光，并通过反应前后发射波长的不同，实现比率型检测，可避免实验因素干扰。利用该探针可对活细胞中内质网硫酸酯酶中的活性与分布进行定量评价，以及利用双光子优势对肿瘤深层组织比率成像，特别适合生物分析以及医学研究。

本发明提供这种硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针，其结构式如(1)所示：

该荧光探针命名为：2-(2-((4-甲基苯基)磺酰氨基)乙基)-1,3-二氧代-2,3-二氢-1H-苯并[de]异喹啉-6-基硫酸氢盐，具有识别前后易观察、高选择性、灵敏度高的特点。

本发明提供所述硫酸酯酶的比率型双光子荧光探针的合成方法，包括以下步骤：

(1)将4-溴-1，8-萘二甲酸酐与N-(2-氨基乙基)-4-甲基苯磺酰胺在乙醇中加热回流8～12h，冷却抽滤干燥得到化合物1；