[发明专利]人成纤维细胞无血清培养基和制备方法及人成纤维细胞无血清调节培养液的获取方法

权利要求书

1.一种人成纤维细胞无血清培养基，其特征在于，包括基础培养基和无血清培养上清浓缩液，还包括如下组分及其浓度：维生素组合物为5~100ng/mL，葡多酚为0~200μg/mL，重组人表皮细胞生长因子为1~50 ng/mL，重组人碱性成纤维细胞生长因子为50~200 ng/mL，重组人转化生长因子β1为1~50 ng/mL，重组血小板衍生生长因子-C为1~10 ng/mL，重组人胰岛素样生长因子-1浓度为1~10 ng/mL，β-巯基乙醇为50~200μM，人血白蛋白浓度为1~100μg/mL，谷胱甘肽浓度为1-100μg/mL，黄芪多糖为1~50μg/mL，透明质酸为0.1~5μg/mL，碳酸氢钠为1.0~3.7g/L；所述基础培养基的体积百分比为90~98%，所述无血清培养上清浓缩液的体积百分比为2~10%；

基础培养基为DMEM培养基，或DMEM培养基与F12培养基的混合培养基；

所述无血清培养上清浓缩液通过以下方法制备：人成纤维细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90%时，收集人成纤维细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液，在无菌条件下，冻存。

2.一种人成纤维细胞无血清培养基的制备方法，采用如权利要求1所述的一种人成纤维细胞无血清培养基，具体包括以下步骤：

步骤1：制备无血清培养上清浓缩液

人成纤维细胞接种于无血清培养基中进行培养，当细胞融合度为80-90%时，收集人成纤维细胞上清液；过滤，超滤浓缩，加水测定总蛋白，得到无血清培养上清浓缩液，在无菌条件下，冻存；

步骤2：制备生长因子浓配液

将重组人表皮细胞生长因子、重组人碱性成纤维细胞生长因子、重组人转化生长因子β1、重组血小板衍生生长因子-C、重组人胰岛素样生长因子-1五款生长因子配制成浓配液A，在无菌条件下，冻存；

步骤3：制备人成纤维细胞无血清培养基；

将维生素组合物、葡多酚、β-巯基乙醇、人血白蛋白、黄芪多糖、谷胱甘肽和透明质酸钠溶解于基础培养基中，混合均匀然后加入碳酸氢钠，过滤，得到混合液B；

将步骤1的无血清培养上清浓缩液、步骤2的冻存的浓配液A加入混合液B中混合均匀，得人成纤维细胞无血清培养基。

3.一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的一种人成纤维细胞无血清培养基制备，具体包括以下步骤：

步骤A：人成纤维细胞的提取：

清理包皮组织、剪碎、洗涤，胶原酶消化后离心，弃上清，沉淀加培养基吹打成细胞悬液，接种于培养瓶中，加入含10%基础培养基的完全培养液进行培养；待细胞达80%融合时进行传代培养，将P1代到P5代细胞作为种子细胞进行冻存；

步骤B：人成纤维细胞的扩增培养：

取步骤A中的种子细胞进行复苏，当细胞融合度为80%-90%时，胰蛋白酶消化细胞传代培养，传代培养基采用人成纤维细胞无血清培养基；

步骤C：收集人成纤维细胞无血清调节培养液：

收集P6到P15代培养过程中的人成纤维细胞调节培养上清液，即得人成纤维细胞无血清调节培养液。

4.如权利要求3所述的一种人成纤维细胞无血清培养液的获取方法，其特征在于，所述步骤B传代培养条件为：温度为37℃，CO₂浓度为5%。