[发明专利]基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法

说明书

基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法，属于林业和植物检疫技术领域。该木毒蛾快速鉴定引物包括上游引物LX‑F和下游引物LX‑R，所述上游引物LX‑F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物LX‑R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明利用普通PCR技术，基于木毒蛾线粒体COI基因设计特异性引物，可快速实现木毒蛾卵、幼虫和虫体不完整情况下的鉴定，可以准确与毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的区分，避免形态鉴定可能产生的混淆。

技术领域

本发明属于林业和植物检疫技术领域，具体涉及基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法。

背景技术

木毒蛾隶属鳞翅目Lepidoptera裳蛾科Erebidae毒蛾亚科Lymantriinae 毒蛾族Lymantriini毒蛾属Lymantria，在进出境检验检疫中非常容易与重要检疫害虫舞毒蛾混淆，毒蛾属包括多种昆虫，木毒蛾与舞毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾、雪松毒蛾等形态相近，尤其是幼虫形态。

现有针对木毒蛾的检验方案即运用形态学方法对木毒蛾与舞毒蛾、雪松毒蛾、栎毒蛾等近缘种进行区分。

然而，形态学鉴定方法的缺陷不仅在于对卵、幼虫和蛹等虫态的鉴定困难,对于虫体不完整的情况也无法作出快速准确的鉴定，木毒蛾与同属其他毒蛾如舞毒蛾、栎毒蛾等在外形非常相似，尤其木毒蛾作为北美地区进境检疫严密监控对象舞毒蛾的近缘种，增加了我国口岸出口船舶贸易检验检疫工作的难度，而目前尚无针对木毒蛾与毒蛾属其他昆虫的快速鉴定方法。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物及其应用、鉴定方法的技术方案。

所述的基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定引物，其特征在于包括上游引物LX-F和下游引物LX-R，所述上游引物LX-F核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物LX-R核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的引物在快速鉴定木毒蛾与其近缘种中的应用。

所述的应用，其特征在于所述木毒蛾近缘种包括舞毒蛾、栎毒蛾、枫毒蛾和雪松毒蛾。

所述的基于普通PCR技术的木毒蛾快速鉴定方法，其特征在于包括以下步骤：

1）取上游引物LX-F和下游引物LX-R，分别对木毒蛾与其近缘种进行特异性PCR扩增；

2）取扩增产物进行电泳，染色，成像分析，若扩增得到424bp条带，则鉴定为木毒蛾。

所述的方法，其特征在于所述步骤1）中PCR反应体系为20μL，包括1 μL模板DNA，10μM上下游引物各0.4μL，2.5mM dNTPs1.6μL，2 μL 10 × PCR buffer，5 U/μL TaqDNApolymerase0.1 μL，13.5 μL ddH₂O，PCR buffer含有Mg^{2 +}；PCR反应条件为：94ºC预变性3min；然后进入循环，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。

本发明利用普通PCR技术，基于木毒蛾线粒体COI基因设计特异性引物，可快速实现木毒蛾卵、幼虫和虫体不完整情况下的鉴定，可以准确与毒蛾属其他昆虫卵块、幼虫等的区分，避免形态鉴定可能产生的混淆。

附图说明

图1为本发明的引物LX-F/ LX-R在木毒蛾上的位置示意图；