[发明专利]沉默小菜蛾整合素β1亚基基因Pxβ的RNAi载体及其应用

说明书

本发明属于农业生物技术领域，涉及沉默小菜蛾整合素β₁亚基基因Pxβ的RNAi载体及其应用。选取小菜蛾整合素β₁亚基基因Pxβ中497 bp的保守序列片段为靶标序列，利用Gateway技术将该靶标序列片段以正反两个方向插入植物表达载体pHellsgate‑4中，构建表达靶标序列dsRNA结构的植物表达RNAi载体；通过农杆菌介导转化法，将该载体插入植物的基因组，获得表达靶标序列dsRNA结构的转基因植株。接虫试验表明转基因植株使小菜蛾靶标基因Pxβ的转录水平下调了44.7%‑49.8%，同时也显著地降低小菜蛾化蛹率，减轻了蛹重，从而导致死亡率升高15.0%，为小菜蛾的防治提供了一种新方法。

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及沉默小菜蛾整合素β₁亚基基因Pxβ的RNAi载体及其应用。一种可以在转基因植物中表达小菜蛾整合素β₁亚基基因Pxβ双链RNA（dsRNA）结构的RNAi载体，通过农杆菌介导的方法将该RNAi载体导入植物基因组，从而获得抗小菜蛾的转基因植株，为小菜蛾的防治提供一种新的策略。

背景技术

小菜蛾(Plutella xylostella L.)是十字花科蔬菜上的全球性重要害虫之一，据估计小菜蛾对我国的经济损失和防治费用每年高达7.7亿美元(Li et al., 2016)。目前，防治小菜蛾的手段依然是以化学农药为主，但大量使用农药不仅对其它生物甚至人类造成危害，而且对环境也会造成污染，更严重的是会对小菜蛾形成抗药性定向选择。已有报道表明小菜蛾对绝大部分农药已经产生了抗药性，并且是第一个被报道在田间对Bt蛋白毒素产生抗性的昆虫(Furlong et al., 2013)。因此，防治小菜蛾的新技术研发已是迫在眉睫。

RNA干扰（RNAi）指外源或内源的双链RNA（double strand RNA，dsRNA）引起生物体内与之互补配对的信使RNA（mRNA）的裂解或抑制其蛋白的表达，这一现象于1998年在线虫中首次报道(Fire et al., 1998)。RNAi技术作为一种基因调控的有效手段，目前已被广泛的应用于昆虫功能基因组学和害虫防治等的研究(胡少茹等, 2019)。在早期的RNAi研究中，一般是通过注射、混合食料饲喂等方式实现基因沉默的效果，但是这些方式在田间害虫防治中的应用比较困难，2007年首次出现了利用转基因植物表达害虫基因dsRNA来防治棉铃虫的报道，即植物介导昆虫RNAi防治害虫(Mao et al., 2007)。通过转基因植物表达害虫靶标基因dsRNA的方式为田间害虫治理提供了一种有效的解决思路。

整合素（Integrin）是一类由α和β亚基通过非共价键组成的异二聚体的跨膜蛋白家族，可由18个α亚基和8个β亚基组成24种不同的整合素(Hynes, 2002)。其中β₁整合素是由β₁亚基和α亚基组成，占到了整合素蛋白家族数量的一半，是生物体组织和器官发育的必需蛋白(Schnittert et al., 2018)。有报道表明喂食小菜蛾整合素β₁亚基基因的dsRNA后，小菜蛾的死亡率可以显著的提高(Mohamed and Kim, 2011)。这些结果说明了整合素β₁亚基基因具有作为植物介导昆虫RNAi防治害虫的靶标基因的潜力。

发明内容