[发明专利]用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法

说明书

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个基因靶点(例如SHOX2和SOX17)的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，经实验测试，本发明试剂盒能够显著提高早期肺癌的阳性检出率和特异性，可将生物标记物的检测灵敏度提高到皮克/纳克级DNA分子，检测灵敏度的提高是通过优化特定核苷酸序列引物及DNA探针以及改进血浆游离DNA的亚硫酸氢盐处理方法来实现的。

技术领域

本发明属于生物技术和DNA检测技术领域，尤其涉及一种用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及其使用方法，具体而言，涉及一种利用血浆游离DNA进行甲基化qPCR以确定一个或多个目标基因靶点(例如SHOX2和SOX17)的甲基化状态来用于肺癌检测或筛查的试剂盒及其使用方法，此外，本发明还涉及上述检测试剂盒在生物医学中的应用。

背景技术

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率列癌症死亡第一位。据美国癌症协会统计，2018年仅在美国就有大约234030例新发肺癌病例和154050例肺癌死亡病例，估计肺癌死亡人数大约相当于结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病和非霍奇金淋巴瘤死亡人数的总和。

临床数据显示，肺癌的预后与确诊时的临床分期密切相关，0期肺癌患者的术后5年生存率为90％，Ia期肺癌患者的术后5年生存率为60％，而II-IV期患者的5年生存率则从40％下降到5％以下。因此，争取“早期发现、早期诊断、早期治疗”，是降低肺癌死亡率的重要措施。然而目前的临床现实是，由于肺癌早期症状并不明显，且受到诊断手段的限制，约75％的患者在中晚期才被诊断出来，从而丧失了最佳的治疗窗口。

临床中肺癌的初步诊断主要通过影像学方法CT扫描发现肺结节进行判断，但CT扫描不能判断结节的良恶性。而肺癌组织病理活检作为肺癌诊断的金标准，往往需要通过CT引导下穿刺、胸膜腔穿刺技术、支气管镜下技术或胸腔镜技术等侵入性方法予以获得肿瘤组织或者细胞进而实施，然而，上述技术均存在感染、出血、气胸、甚至死亡等风险。因此，利用非侵入性方法辅助肺癌早期筛查及诊断在临床上有着极为广阔的应用前景。

液体活检是用检测分子生物标志物来替代传统组织活检的非侵入性方法，其用于分析的生物样品(如DNA)可以从血液、尿液、唾液、痰液或组织样本中获得。与传统的癌症诊断方法相比，液体活检具有以下优势：

1.易取得，液体活检样本可从尿液、唾液和胸腔积液中获得；

2.比传统的肿瘤活组织检查更少侵入性；

3.能取样所有可能的癌细胞，而非仅局限于肿瘤活检的某部分；

4.便于早期发现癌症；

5.能用于监测肿瘤动态(治疗前、治疗间和治疗后)；

6.具有能作为理想识别标靶治疗因子的潜力。

坏死或凋亡的细胞释放到血液中的DNA，被称为循环游离DNA(circulating freeDNA，cfDNA)，然而在肿瘤患者的血液中，一部分cfDNA来自死亡的肿瘤细胞，这部分DNA就被定义为循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)，其主要是由单链或双链DNA以及单链与双链DNA的混合物组成，以DNA蛋白质复合物或游离DNA两种形式存在，这些ctDNA多为大约134-144bp的DNA片段，并携带一定的肿瘤特征(包括异常甲基化、突变、缺少、插入、拷贝数等)。较早期的癌症(意味着肿瘤尺寸较小且癌细胞较少)，释放较少的游离循环肿瘤ctDNA，而其浓度更小于游离cfDNA；当肿瘤负荷增加时，患者的ctDNA水平会升高。迄今为止，ctDNA是获得癌症患者血液中分子肿瘤相关改变的诊断、预后、以及预测信息的最佳材料。