[发明专利]一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒检测方法

权利要求书

1.一种检测通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的引物对和探针组，其中包含有：

1)鉴定通用型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:1、反向引物的序列为SEQID NO:2、探针的序列为SEQ ID NO:3；

2)鉴定H5亚型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:4、反向引物的序列为SEQID NO:5、探针的序列为SEQ ID NO:6；

3)鉴定H7亚型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:7、反向引物的序列为SEQID NO:8、探针的序列为SEQ ID NO:9；

4)鉴定H9亚型禽流感病毒的正向引物的序列为SEQ ID NO:10、反向引物的序列为SEQID NO:11、探针的序列为SEQ ID NO:12。

2.如权利要求1所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的探针分别用不同的荧光RT-PCR检测用的荧光素进行标记。

3.如权利要求2所述的引物对和探针组，其特征在于，所述的鉴定通用型禽流感病毒的探针的5′端进行羧基荧光素ROX标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记；

鉴定H5亚型禽流感病毒的探针的5′端进行羧基荧光素HEX标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；

鉴定H7亚型禽流感病毒的探针的5′端进行羧基荧光素FAM标记，3′端进行淬灭基团BHQ1标记；

鉴定H9亚型禽流感病毒探针的5′端进行羧基荧光素CY5标记，3′端进行淬灭基团BHQ2标记。

4.权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组在制备荧光RT-PCR检测试剂盒中的应用。

5.一种荧光RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中使用了权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组。

6.一种非疾病诊断治疗目的地的检测禽流感病毒的方法，其特征在于，所述的方法使用了权利要求1-3任一项所述的引物对和探针组。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：

1)配制荧光定量RT-PCR反应体系：

反应液每管50μL，含有2×One Step RT-PCR BufferⅢ25.0μL，5U/μL TaKaRa Ex TaqHS 1.0μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ1.0μL，10pmol/μL AIV-M forward、AIV-Mreverse和AIV-M probe各1.0μL，10pmol/μL H5forward、H5 reverse和H5 probe各1.0μL，10pmol/μL H7 forward、H7 reverse和H7 probe各1.0μL，10pmol/μL H9 forward、H9reverse和H9 probe各1.0μL，RNase Free dH2O 7.0μL，待检测的样品RNA模板4μL；

2)荧光定量RT-PCR反应体系扩增：

将检测反应条件设置为：第一阶段，42℃/5min；第二阶段，95℃/10s，第三阶段，95℃/5s，60℃/20s收集荧光，40个循环；

3)结果判定：

结果分析条件设定：读取检测结果；阈值设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，不同仪器可对阈值线的位置进行调整，然后读取检测结果；

质控标准:阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；阳性对照的Ct值应≤36.0，并出现特定的扩增曲线样品判为阳性。