[发明专利]一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒检测方法

说明书

本发明的目的是提供一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重实时荧光RT‑PCR的检测方法，以实现对通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒进行安全、特异、灵敏、快速、方便的检测。本发明提供一种基于分子生物学的快速检测通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重荧光RT‑PCR检测方法，以实现对通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒进行安全、特异、快速、灵敏、简单、高通量的快速检测，从而弥补现有传统检测技术的不足。并且此方法非常适用于高通量检测，能够同时检测大量样品并快速判定结果，而且使用TaqMan荧光探针，避免传统SYBR Green染色法造成的污染和低特异性。

技术领域

本发明属于荧光定量RT-PCR检测技术领域，具体涉及一种通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的四重实时荧光RT-PCR的检测方法，包括分别用于鉴定通用型、H5亚型、H7亚型及H9亚型禽流感病毒的引物对和探针。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)为单股负链RNA病毒，由8个独立的RNA节段组成，显著的生物学特征之一是亚型众多，变异频繁。迄今为止从禽类体内已经分离到上千种毒力各异的毒株，根据其病毒粒子表面的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的抗原性差异，分为18种HA亚型(H1-H18)和11种NA亚型(N1-N11)。不同亚型毒株对宿主的致病力差异显著，根据致病力可以把禽流感病毒分为高致病性禽流感病毒和低致病性禽流感病毒。在所有HA亚型中，只有H5和H7亚型对禽是高致病性的，称为高致病性禽流感(Highpathogenic avian influenza，HPAI)，该类病毒可引起鸡群100％死亡，被国际兽疫局确定为A类传染病。

Perroncito于1878年在意大利首次报道了H5亚型高致病性禽流感。H5亚型禽流感的发生给养禽业造成严重危害。禽流感爆发对中国家禽养殖农户的生计造成了巨大的冲击，农户的家禽养殖收入和家庭收入均显著下降。H5亚型禽流感病毒还可感染人，可造成人的发病和死亡的公共卫生问题。1997年，我国香港地区首次报道禽流感病毒直接感染人至发病和死亡。此次疫情是高致病性H5N1亚型禽流感病毒首次跨越种属屏障，由家禽感染人类，共计报告18例病例，其中6例死亡。2003年初，香港又再次出现2例人感染H5N1高致病性禽流感个案，其中1例死亡。之后的1年多，人感染H5N1高致病性禽流感病例在东南亚地区多个国家相继出现，包括越南、泰国、中国大陆、柬埔寨。世界卫生组织报道，至2014年全球总共发生感染H5N1禽流感的病例达649例，其中死亡385例，死亡率高达59.32％。

近年来时有H7亚型流感病毒爆发，如1999～2000年在意大利爆发的H7N1病毒导致1300多万羽鸡死亡，造成重大经济损失。2003年荷兰爆发了H7N7亚型禽流感，不仅造成了重大的经济损失，而且感染89人。自2013年2月以来，我国华东地区上海市、安徽省、江苏省、浙江省先后发生不明原因重症肺炎病例，于3月31日将其确诊为人感染H7N9禽流感病毒。在我国还出现了致死禽类的高致病性H7N9禽流感病毒。这些事件表明H7亚型禽流感的危害已不仅是对养禽业的破坏，还对人类健康构成潜在的威胁。

我国常见的低致病性禽流感主要是由H9亚型禽流感病毒引起，近几年在世界上许多国家都暴发了H9亚型禽流感疫情。H9亚型禽流感病毒已经能传播至哺乳动物，包括猪和人类，可在家禽、野鸟、猪和人群中造成不同程度的致病力和毒力。我国自1994年首次报道从鸡群中分离到H9亚型禽流感病毒以来，目前绝大部分省市都有H9亚型禽流感的流行，给我国的养禽业造成巨大的经济损失。由于高致病性禽流感的高度破坏性，并且已被列入政府强制免疫计划的疫病，养鸡户对其防控很重视，而忽视了对低致病性禽流感的防范，从而造成了以H9亚型为主的低致病性禽流感的大范围流行和对养禽业的持续危害。