[发明专利]一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法

权利要求书

1.一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，所述方法用于非疾病诊断目的食品样品或细菌菌株中单增李斯特菌的血清型分型，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将待检测的食品样品或细菌菌株样品进行增菌培养，得到增菌培养液；

(2)使用试剂盒法提取步骤(1)所述增菌培养液的基因组DNA，得到待鉴定的DNA提取液；

(3)将步骤(2)所述待鉴定的DNA提取液、鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与PCR反应物混合均匀，得到PCR反应体系，然后进行PCR反应，得到PCR反应产物，所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物包括PCR引物lmo2644、PCR引物LMOf2365_0118、PCR引物lmo1119及PCR引物lmo0733，所述PCR引物lmo2644包括正向引物lmo2644-F和反向引物lmo2644-R，所述正向引物lmo2644-F如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物lmo2644-R如SEQ ID NO:2所示；所述PCR引物LMOf2365_0118包括正向引物LMOf2365_0118-F和反向引物LMOf2365_0118-R，所述正向引物LMOf2365_0118-F如SEQ ID NO:3所示，所述反向引物LMOf2365_0118-R如SEQID NO:4所示；所述PCR引物lmo1119包括正向引物lmo1119-F和反向引物lmo1119-R，所述正向引物lmo1119-F如SEQ ID NO:5所示，所述反向引物lmo1119-R如SEQ ID NO:6所示；所述PCR引物lmo0733包括正向引物lmo0733-F和反向引物lmo0733-R，所述正向引物lmo0733-F如SEQ ID NO:7所示，所述反向引物lmo0733-R如SEQ ID NO:8所示；

(4)将步骤(3)所述PCR反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到电泳结果图，如果所述电泳结果图上出现669bp和500bp条带，则判定步骤(1)待检测的样品中单增李斯特菌的血清群为IIa，其血清型为1/2a或3a；若只出现500bp的条带，则判定为血清群IIb，即血清型1/2b、3b或7；若只出现669bp、243bp和500bp的条带，则判定为血清群IIc，即血清型1/2c或3c；若只出现889bp和500bp的条带，则判定为血清群IVb，即血清型4b、4d或4e；若只出现669bp、889bp和500bp的条带，则判定为血清群L，即血清型4a或4c；如果所述电泳结果图上没有出现以上条带，则步骤(1)待检测的样品中不含有单增李斯特菌，判断为单增李斯特菌阴性。

2.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤(1)所述增菌培养使用的培养基为TSB培养基，所述增菌培养是在摇床中振荡培养，所述增菌培养的温度为36～38℃，所述增菌培养的时间为8～12h，所述增菌培养的摇床转速为210～230rpm。

3.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤(2)所述待鉴定的DNA提取液中的DNA浓度为10-500ng/μL。

4.根据权利要求1所述的基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR反应体系，按体积份数计，包含：

其中，所述10×PCR反应缓冲液的pH值为8.2～8.4；所述dNTP溶液为dATP、dGTP、dTTP和dCTP这四种脱氧核糖核苷三磷酸等比例与水混合均匀得到的溶液，所述dNTP溶液中四种脱氧核糖核苷三磷酸的浓度均为10～15mM；所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液为鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物与水混合均匀得到的溶液，所述鉴定单增李斯特菌血清型的PCR引物溶液中引物的浓度为各8～12μM；所述Taq酶溶液为Taq酶与水混合均匀得到的溶液，所述Taq酶溶液的浓度为2～3U/μL；所述水为无菌且无核苷酸的超纯水。