[发明专利]一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法

说明书

本发明公开了一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。该方法包括：将待测单增李斯特菌菌株进行增菌培养，得到增菌培养液；提取增菌培养液的DNA，将DNA提取液、PCR引物与PCR反应物混合均匀，进行PCR反应，得到PCR反应产物；将PCR反应产物电泳，根据电泳结果判断待检测菌的血清型。本发明针对新挖掘到的单增李斯特菌血清型的特异性靶标lmo2644、LMOf2365_0118、lmo1119、lmo0733基因设计特异性引物，并建立单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法。这些靶标具有准确度高和特异性好的特点。该方法具有准确度高、特异性好、鉴定速度快、成本低廉及操作简单的特点。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。

背景技术

单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌，是一种人畜共患的食源性致病菌。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，会导致许多食品中的污染，并可承受食品加工过程中常见的环境压力。单增李斯特菌抗盐碱、耐冷，在20％的盐浓度下仍可存活，在4℃下仍可生长繁殖。单增李斯特菌是引起李斯特菌病的唯一人类病原体，主要感染老年人、孕妇、儿童和免疫功能低下者。李斯特菌病的临床表现包括脑膜炎、脑炎、流产、发热性胃肠炎和败血症等，李斯特菌病的死亡率高达30％。因此，大多数国家都对食品中的单增李斯特菌进行严格控制，特别是在即食食品中。

根据菌体和鞭毛抗原的血清型反应，单增李斯特菌可被分为13个血清型，分别为1/2a、1/2b、1/2c、3a、3b、3c、4a、4ab、4b、4c、4d、4e和7型。其中，1/2a、1/2b、1/2c、4b这4种血清型是主要的血清型，99％的人类李斯特菌病由这四种血清型的菌株引起。1/2a血清型是食品中最为常见的血清型，但李斯特菌病的暴发性流行大多是由4b血清型的菌株引起的，这说明4b血清型可能具有更强的毒力。以上13种血清型可进一步被分为5个血清群(serogroup)，1/2a和3a型属于IIa群，1/2b、3b和7型属于IIb群，1/2c和3c型属于IIc群，4b、4d和4e型属于IVb群，4a和4c型属于L群。对单增李斯特菌的血清型鉴定，在其流行株的监测、食品安全性评估及暴发疫情的病原学溯源中具有重要的应用价值。

目前，对单增李斯特菌血清型的鉴定方法主要是血清型方法(可见出入境检验检疫行业标准SN-T 2521-2010)，此种方法需要使用菌毛抗原和菌体抗原，成本较高，操作复杂，易发生交叉反应，且鉴定周期较长，完成一次鉴定需要3天以上的时间。

现有专利中，单增李斯特菌血清型的PCR鉴定方法，如CN 107746890 A、CN103602739 A等专利中使用的靶标使用Primer-BLAST进行验证，发现仍缺少准确度和特异性都较好的单增李斯特菌血清型PCR鉴定引物；然而，目前对单增李斯特菌血清型的新PCR鉴定靶标的挖掘的相关文献报道较少。对其新PCR鉴定靶标的挖掘和新的PCR鉴定方法的建立，有助于提高单增李斯特菌血清型PCR鉴定的准确度和特异性。

发明内容

为了克服现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法。

本发明的目的至少通过如下技术方案之一实现。

本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，是一种特异性好、鉴定速度快、成本低廉、操作简单的单增李斯特菌的PCR鉴定方法。

本发明提供的一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重PCR方法，该PCR方法使用的血清群IIa、IIc、L特异性靶标基因为lmo2644，血清群IVb、L特异性靶标基因为LMOf2365_0118、血清群IIc的特异性靶标基因为lmo1119、单增李斯特菌特异性靶标基因lmo0733。