[发明专利]胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试剂盒

权利要求书

1.一种同步检测胡椒黄斑驳病毒(Piper yellow mottle virus，PYMoV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的多重PCR引物组合，其特征在于，所述多重PCR引物组合由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

2.一种同时检测胡椒是否感染胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的试剂盒，包括权利要求1所述的多重PCR引物组合。

3.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括2×Taq PCRMastermix、灭菌ddH₂O。

4.根据权利要求2所示的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括阳性对照；所述阳性对照为序列表中序列5和序列6分别与pMD18-T连接的重组质粒的等拷贝数混合物。

5.权利要求1所述的多重PCR引物组合、权利要求2、3或4所述的试剂盒在同时检测胡椒是否感染胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒中的应用。

6.一种同时检测胡椒是否感染胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的方法，包括下述步骤：

1)提取待测胡椒叶片样品总RNA，以提取的RNA为模板进行反转录，获得反转录产物cDNA；

2)以反转录产物cDNA为模板，利用权利要求1所述引物组合，进行多重PCR扩增；

PCR反应体系总体积为25μL，其中含有2×Taq PCR Mastermix 12.5μL、10μmol/L的序列表中序列1所示的核苷酸1μL、10μmol/L的序列表中序列2所示的核苷酸1μL、10μmol/L的序列表中序列3所示的核苷酸0.5μL、10μmol/L的序列表中序列4所示的核苷酸0.5μL，反转录产物cDNA 1μL和灭菌ddH₂O 8.5μL；

(3)结果判定：用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，当出现1325bp大小的电泳条带时，说明胡椒叶片中含有胡椒黄斑驳病毒；当出现833bp大小的电泳条带时，说明胡椒叶片中含有黄瓜花叶病毒；当同时出现1325bp和833bp两个条带时说明胡椒叶片含有胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒两种病毒。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述多重PCR扩增的反应条件为：PCR反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性45s，50.1℃退火45s，72℃延伸45s，循环35次；72℃延伸10min。