[发明专利]胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试剂盒

说明书

本发明公开了一种同时检测胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR方法及其专用试剂盒。所述检测方法包括：提取待测胡椒叶片样品总RNA，进行反转录，获得反转录产物cDNA；以反转录产物cDNA为模板，利用引物组合，进行PCR扩增；通过对反应产物的电泳分析来判定样品中是否含有胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒。所述引物组合由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。本发明中的检测方法具有快速准确、特异性强、检测结果易辨别和节约成本等特点，为胡椒病毒病害的早期诊断和监测提供技术支撑，对田间病毒病害的防控具有十分重要的意义。

技术领域

本发明属于植物病毒学技术领域，具体涉及一种胡椒叶片中胡椒黄斑驳病 毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试剂盒。

背景技术

胡椒(Piper nigrum L.)为胡椒科(Piperaceae)胡椒属(Piper)的一种多 年生常绿藤本植物，被誉为“香辛料之王”，是世界最重要的香辛料作物。我国是世 界六大胡椒主产国之一。海南、广东、广西、云南和福建等省均有种植，其中海南 是我国胡椒的主产区，主要分布在海口、文昌、琼海、万宁和定安等5个市县，海 南的种植面积和产量分别占全国83.88％和92.42％以上，种植面积31.95万亩，年总 产量达3.66万吨，年均产值超过30亿元(2016年全国南亚办热带作物生产统计数 据)。

病毒病是胡椒生产上的一类重要病害，目前国内外已明确侵染胡椒并造成为害的病毒有两种，分别是胡椒黄斑驳病毒(Piper yellow mottle virus，PYMoV)和 黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)。两种病毒经常复合侵染胡椒，引起 胡椒叶片花叶、斑驳、变狭和卷曲皱缩，节间变短，植株矮缩，生长缓慢，严重影 响胡椒产量，目前尚无有效的化学药剂防治胡椒病毒病。

通过插条进行扦插是生产上胡椒的主要繁殖方法，病毒病可以通过带病的扦插条大范围、快速的传播，所以选取健康的胡椒植株作为扦插条母株，种植健康扦插 条，从源头控制病毒病的发生是田间控制病毒病的最经济有效的措施之一。PYMoV 和CMV两种病毒在田间均存在隐症现象，即在一定的环境条件下，症状暂时消失， 一旦恢复适宜的发病条件，症状又可以重新出现，这种现象导致田间难以判断未显 症植株是否携带病毒。

多重PCR(Multiplex Polymerase Chain Reaction，mPCR)是在同一PCR反应 体系里加上二对或二对以上特异性引物，同时扩增出两种或两种以上核酸片段的PCR 反应，从而通过一次PCR反应能同时检测两种或两种以上的病原。该项技术因其同 步、快速和准确等优点已被广泛应用于病毒、细菌、真菌等病原物的检测。目前未 有利用多重PCR技术同时检测PYMoV和CMV 2种病毒的相关文献和专利。本发明建 立了一种胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的多重PCR检测方法及专用试 剂盒，可以同步、快速和准确的检测PYMoV和CMV，为胡椒病毒病害的早期诊断提 供技术支撑，对田间病毒病害的防控具有十分重要的意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种同步检测胡椒叶片中胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花 叶病毒的多重PCR引物、检测方法及专用试剂盒。该方法具有快速准确、特异 性强和检测结果易辨别的特点。

本发明第一方面提供一种同步检测胡椒黄斑驳病毒和黄瓜花叶病毒的引 物组合，所述引物组合由序列表中序列1所示的核苷酸、序列表中序列2所示 的核苷酸、序列表中序列3所示的核苷酸和序列表中序列4所示的核苷酸组成。

其中，用于检测胡椒黄斑驳病毒的特异性引物的核苷酸序列为：

PYMoV-F：ACTGGGAAGGAGGTCAAAGG(序列表中序列1)

PYMoV-R：GAGGGTGTCTTGGTACTGCT(序列表中序列2)

用于检测黄瓜花叶病毒的特异性引物的核苷酸序列为：