[发明专利]结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法

权利要求书

1.一种MCDA反应体系在制备利用多交叉置换扩增MCDA方法检测肺炎链球菌Ply基因的检测试剂中的用途，所述多交叉置换扩增MCDA方法中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1，其特征在于，

标准MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为1.6μM,置换引物F1和F2的浓度为0.4μM，扩增引物C1*,C2,D1*,D2,R1和R2的浓度为0.8μM，12.5μL的2×反应缓冲液，1μL Bst DNA聚合酶(10U)，1μL的DNA模板，补加去离子水至25μl，整个反应恒温在温度62-67℃40min，85℃5min终止反应，即得双标MCDA基因片段；

所述引物选自下列序列组合：

如SEQ ID NO:1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO:2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO:3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO:4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO:5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO:6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO:7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO:8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO:9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO:10所示的扩增引物R2；

在所述扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；

采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；

所述双标MCDA基因片段的扩增效果检测评价采用金纳米方法。

2.根据权利要求1所述的一种MCDA反应体系在制备利用多交叉置换扩增MCDA方法检测肺炎链球菌Ply基因的检测试剂中的用途，其特征在于，所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为10fg-10ng。

3.根据权利要求1所述的一种MCDA反应体系在制备利用多交叉置换扩增MCDA方法检测肺炎链球菌Ply基因的检测试剂中的用途，其特征在于，所述温度为65℃。

4.根据权利要求1所述的一种MCDA反应体系在制备利用多交叉置换扩增MCDA方法检测肺炎链球菌Ply基因的检测试剂中的用途，其特征在于，进行所述双标MCDA基因片段的扩增效果检测评价时，依次将所述双标MCDA基因片段、检测缓冲液滴加在检测器具表面。

5.根据权利要求4所述的一种MCDA反应体系在制备利用多交叉置换扩增MCDA方法检测肺炎链球菌Ply基因的检测试剂中的用途，其特征在于，所述双标MCDA基因片段与所述检测缓冲液用量体积比为1：600。

6.根据权利要求4所述的一种MCDA反应体系在制备利用多交叉置换扩增MCDA方法检测肺炎链球菌Ply基因的检测试剂中的用途，其特征在于，所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；

所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。